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豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测

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豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测 《搏CERE铷AL&F饲EED料IND工USTORY2013,No.4 豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测 李旺军,方 华,季春源 (上海源耀生物科技有限公司,上海201316) ■ 摘 要:介绍了豆粕和发酵豆粕产品中抗原蛋白和不良寡耱的检测方法,并将从市场上收集到的不同生产厂家发 酵豆粕产品,分别通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和薄板层析法检测其中抗原蛋白和不良寡糖的降解情况,同时做了 简要分析。结果表明:不同厂家生产的发酵豆粕产品有很大的差异,抗原蛋白和不良寡糖的降解情况参差不齐: 部分产品中的抗原蛋白和不良寡...
豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测
《搏CERE铷AL&F饲EED料IND工USTORY2013,No.4 豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测 李旺军,方 华,季春源 (上海源耀生物科技有限公司,上海201316) ■ 摘 要:介绍了豆粕和发酵豆粕产品中抗原蛋白和不良寡耱的检测方法,并将从市场上收集到的不同生产厂家发 酵豆粕产品,分别通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法和薄板层析法检测其中抗原蛋白和不良寡糖的降解情况,同时做了 简要分析。结果明:不同厂家生产的发酵豆粕产品有很大的差异,抗原蛋白和不良寡糖的降解情况参差不齐: 部分产品中的抗原蛋白和不良寡糖与豆粕相当,完全没有降解;抗原蛋白和不良寡糖均完全降解的产品并不多。 关键词:豆粕;固态发酵;抗原蛋白;不良寡糖;聚丙烯酰胺凝胶电泳法;薄板层析法;饲料 中图分类号:S816.2;$816.42文献标志码:B 文章编号:1003—6202(2013)04—0061一05 豆粕中的抗营养因子分为两类:热稳定性抗营 养因子,主要包括大豆抗原蛋白(球蛋白和B一伴球蛋 白)和大豆寡糖(主要为水苏糖和棉籽糖)等;热敏性 抗营养因子,包括胰蛋白酶抑制因子、脲酶和凝集素 等。热敏性抗营养因子通过加热的方法就能使其钝 化失活,膨化就是一种非常有效的方法;豆粕中的胰 蛋白酶抑制因子、脲酶和凝集素等热敏性物质通过 原料灭菌即可使其失活,但球蛋白、p伴球蛋白、棉 籽糖和水苏糖等热稳定性抗营养因子在一般的饲料 jJnT_过程中不易被破坏¨]。由于这些热稳定性抗营 养因子在动物的饲喂过程中会引起一系列的过敏反 应,因此需要通过其他方法在体外进行处理,采用微 生物发酵法处理豆粕不仅成本低,对饲料营养成分 的影响与破坏较小,而且可以同时去除多种抗营养 因子,还可积累有益的代谢产物和益生菌,这是豆粕 进行发酵的主要目的L2j。 发酵豆粕是一种新开发的优质蛋白质饲料原 料,可以弥补我国蛋白质饲料原料的不足。它是一 种利用现代生物工程发酵技术,以优质豆粕为原料, 将大豆蛋白降解为小分子蛋白,并将抗营养因子彻 底分解的优质蛋白原料。同时,在微生物发酵过程 中产生大量有益代谢产物、乳酸、未知生长因子 (UGF)等,因此发酵豆粕被认为是可以替代鱼粉、 肉骨粉等动物蛋白的理想植物蛋白。最近几年,发 酵豆粕产品受到饲料企业和养殖业的青睐,应用越 来越广泛,它的主要优点总结起来有以下4个方面: (1)发酵的方法能够很好地去除豆粕中的热稳 定性抗营养因子,如抗原蛋白和不良寡糖;(2)通过 发酵,部分大豆蛋白被微生物降解为小分子蛋白,提 高了植物蛋白的消化吸收率;(3)发酵产品中会产生 有益代谢产物,如含有2%~3%的有机酸;(4)通过 发酵,原料粗蛋白质含量得到浓缩,产品具有发酵香 味,适口性好。 正因为有上述的优点,很多饲料厂已将发酵豆 粕产品作为一种重要的蛋白原料列入配方,尤其是 规模养猪场更是广泛使用这类产品。但是,目前饲 料厂遇到的一个最现实的问题是:市场上这类产品 良莠不齐,鱼目混杂,至今还没有出台统一的国家标 准或行业。为此,笔者根据多年的研究工作经 验,结合市场实际,以上海源耀生物科技有限公司生 产的豆粕发酵蛋白为例,分别采用聚丙烯酰胺凝胶 电泳和薄板层析对比检测不同厂家的发酵豆粕产品 中抗原蛋白和不良寡糖的降解情况并作简要分析, 供同行参考。 1抗原蛋白的定性检测 抗原蛋白的定性检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS—PAGE)C3J。 1.1仪器设备 蛋白电泳仪:电泳仪(DYY~2C型)、电泳槽 (DN一24型)、25“l微量进样器、移液枪(1000、200、 lo“1)以及其配套枪头;制胶装置:与电泳槽配套出 售,包括玻璃板(厚度分别为1.0和1.5mill各 1套),梳子。 1.2 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵和N,N, N’,N’一四甲基乙二胺(TEMED)均购自上海某生 物科技有限公司,为分子生物等级(MB);无水酒 收稿日期:2012—09—28;修回日期:2013—04一01 作者简介:李旺军(1979一),男,硕士,工程师,主要从事微生物与发酵工程方面的研发工作。 万方数据 固 李旺军等:豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测/2013年一4期 精、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、考马斯亮兰 R250、甲醇、冰醋酸、甘油(丙三醇)、8一巯基乙醇、溴 酚蓝、盐酸、十二烷基硫酸钠(SDS),均为市售分析 纯(AR)。 1.3试剂的配置 1.3.1备用溶液的配置 质量分数30%丙烯酰胺母液:取丙烯酰胺 30.0g、甲叉双丙烯酞酰胺0.8g,用蒸馏水定容至 100ml棕色试剂瓶保存备用。 质量分数10%过硫酸铵:将1g过硫酸铵溶于 10.00ml蒸馏水中。 2.00mol/LTris—HCI(pH一8.8):称取Tris 121.14g溶于500ml蒸馏水中,用浓盐酸调节pH 值至8.8(要求准确)。 1.00mol/LTris—HCI(PH=6.8):称取Tris 60.57g溶于500ml蒸馏水中,用浓盐酸调节pH 值至6.8(要求准确)。 质量分数10%SDS:称取5gSDS溶于50ml 蒸馏水中。 质量分数1.0%溴酚兰:称取0.05gSDS溶于 5ml蒸馏水中。 样品浸提液:准确称取Tris3.63g,用蒸馏水定 容至1L,用HCI调节pH值至8.0。 电泳缓冲液:称取Tris3.0g、甘氨酸14.4g、 SDSl.0g,用蒸馏水定容至lL,用HCl调节pH值 至8.3。 染色液:称取考马斯亮兰(R250)0.25g,量取甲 醇45.40ml、冰醋酸9。20ml、蒸馏水45。40ml,混 合溶解后在棕色试剂瓶保存备用。 脱色液:量取甲醇456.0ml、冰醋酸72.0ml、 蒸馏水472.0ml,混合均匀即得。 1.3.2各种缓冲溶液的组成(见表1) 1.3.3分离胶和浓缩胶溶液的组成(见表2) 表1缓冲溶液的组成 表2分离胶和浓缩胶的组成 注:每次加完一种溶液后轻轻地晃动容器使其混合均匀。 1.4分离胶的配制 将洁净的玻璃片置于制胶支架上(缺口朝里), 放平、压紧,按照要求的体积分别将30.0%丙烯酰 胺母液、4×分离胶缓冲液与蒸馏水放在小烧杯中混 合,再加入10.0%过硫酸铵和(TEMED,混匀后用 移液枪吸取混合液小心沿玻壁倒入至液面距离玻璃 板顶部约2cm);然后覆盖一层无水乙醇(高约 2mm,此时可以明显看出分离胶与无水乙醇的分层 线,切不可过分晃动胶板,防止乙醇进入分离胶内 部,阻碍其凝结),静置等待凝胶聚合。 1.5堆积胶(浓缩胶)的配制 首先用滤纸将分离胶上面的一层无水乙醇吸 干,然后按照要求的体积分别将质量分数30.0%丙 烯酰胺母液、4×堆积胶缓冲液与蒸馏水放在小烧杯 中混合,再加入质量分数10.0%过硫酸铵和 TEMED,混匀后用移液枪吸取混合液小心沿玻壁 倒入,当凝胶溶液距离玻璃板的顶端约0.5cm时, 将梳子插入凝胶内,静置等待凝胶聚合后小心将梳 子拔出(注意:温度的升高可加速胶的凝结速度,但 是过高的温度会造成胶的皱缩,一般控制其凝结温 度为30℃左右)。 1.6抗原蛋白的提取 取豆粕(对照样品)和发酵豆粕样品1。og,分别 加入20.ooml0.03mol/L的Tris—HCI(pH一8.0) 在室温下浸泡1h后(每20rain晃动1次), 10000r/rain下离心10min,取上清液备用H)。 1.7上样电泳 取上清液80pl,加入20肛15×样品缓冲液(蓝 色,样品与样品缓冲液以4:1的比例混合),沸水浴 3rain后,进行SDS—PAGE电泳:取各样品溶液 10肚1分别加入到凝胶槽中,开启稳压电源开关,设 置电压180V进行垂直式电泳,当样品缓冲液的蓝 色条带迁移到凝胶底部时结束电泳。 1.8 染色与脱色 将凝胶用拨胶版小心剥下,放人装有染色液的 容器中,在转速为40~60r/min的摇床上染色 万方数据 李旺军等:豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测/2013年■4啊 30min后转放于脱色液中浸泡过夜,期间更换2~ 3次脱色液,直到凝胶的背影颜色为初始的白色且 条带清晰可见为止。 1.9拍照保存 将脱色后的凝胶小心置于自封袋中,然后使用 扫描文件用的扫描仪或者照相机拍摄胶片,记录并 保存。 1.10结果与分析 豆粕中的抗原蛋白主要包括两种:球蛋白(Gly— cinin,11S)和B一伴球蛋白(p-Conglycinin,7S)。球 蛋白(11S)由6个酸性亚基和6个碱性亚基通过共 价键形成一个聚合体;B一伴球蛋白(7S)包含a、a’和B 3个亚基,由于这3个亚基都含有4%~5%的碳水 化合物,因此p伴大豆球蛋白是糖蛋白嘲。采用 SDS—PAGE法检测豆粕中抗原蛋白的组成,结果见 图1。 图1豆粕中抗原蛋白的SDS-PAGE指纹图谱 从图1中可看出,豆粕中抗原蛋白分子量范围 为22~76ku,均属于大分子蛋白。图l中标示的 5条蛋白条带组成和大小不会因为豆粕的种类或粗 蛋白质含量等不同而改变,只是条带的亮度会不一 样,因此可以将SDS—PAGE法检测的豆粕中的抗原 蛋白图谱作为豆粕的指纹。如果图谱的条带与豆粕 相比,位置发生了变化则可能是掺人了其他的蛋白 原料。采用同样的方法检测饲料中常用的其他植物 蛋白原料的SDS-PAGE指纹图谱,结果见图2。 对比图1和图2中不同原料的蛋白条带组成可 以发现,相同的操作条件下,原料不一样,蛋白的条 带数目、位置和亮度不一样,也可以说各自的指纹图 谱不同。因此,如果发酵蛋白类产品的大分子蛋白 未被降解,可以采用SDS-PAGE指纹图谱推断其中 的原料组成情况。 63 l旦杆I;!化生“l;:{菜籽柏;l怖籽柏;j』三|水酒糟粕 图2饲料中常用的其他植物蛋白原料的 SDS-PAGE指纹图谱 通过收集市场上不同厂家的发酵豆粕样品,采 用SD孓PAGE法检测其中抗原蛋白的降解情况,结 果见图3。 1、6、9一显粕;2-湖北地区某件品;3北尿地区某样晶o 4一广东地区某样品;5-台湾地区某样品;7、8一上海某发酵蛋白 图3不同厂家发酵豆粕样品的 抗原蛋白检测结果(SDS-PAGE指纹图谱) 从图3中可看出,检测的湖北、北京和广东地区 某样品的抗原蛋白条带组成与豆粕完全相同,说明 经过发酵后其中的抗原蛋白完全没有降解;台湾地 区某样品的抗原蛋白基本降解,但是蛋白条带的位 置和亮度与豆粕有差异,可能混有其他的蛋白原料; 对比图2中的指纹图谱可知,它的指纹图谱与花生 粕的比较相似;豆粕发酵蛋白样品的抗原蛋白经过 发酵后大分子蛋白完全降解,表现为对应豆粕中同 一水平位置的条带完全消失,说明豆粕中的大分子 蛋白经过发酵后被完全降解。 由于不同的豆粕发酵生产厂家的生产工艺有所 不同,为了检验抗原蛋白检测方法的可重复性和准 确性,验证可能影响其检测结果的因素,因此本文有 针对性的考察豆粕发酵过程中热处理的操作对抗原 蛋白检测的影响,采用SDS—PAGE分别检测生豆 粕、干热灭菌的豆粕和湿热灭菌的豆粕样品中抗原 蛋白的降解情况,结果见图4。 从图4中可以看出,生豆粕分别在干热和湿热 灭菌的条件下处理,经过SDS—PAGE检测后抗原蛋 白条带数目和亮度与生豆粕相比,几乎没有变化,说 明在当前的热处理条件下温度对抗原蛋白的检测没 万方数据 64 李旺军等:豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检溯1/2013年囊4啊 有影响。也即豆粕发酵过程中的热处理操作不会掩 蔽SDS-PAGE对抗原蛋白的检测,因此,豆粕发酵 后如果抗原蛋白没有降解,从发酵的目的上来说,那 就是生产工艺和技术没有达到预期的效果,这方面 的内容涉及到发酵原理和大规模的生产,在此 不作赘述。 3 2 l 滠热灭菌 干热灭菌 l生卫粕为豆粕直接粉碎后的样品L粒度≤U.4mmj;2f:热灭 菌后的豆粕(粒度≤0.45mm)120℃分别保温5、lOmin;3-湿热灭菌 后的豆粕为豆粕与水1:i混合后的样品,120"C分别保温5、 10min,取出冷却后40℃晾干,然后粉碎(粒度≤0.4mm) 图4温度对豆粕样品中抗原蛋白降解情况的影响 2不良寡糖的检测(薄层色谱层析,TLC)嘲 2.1 仪器设备 硅胶板G型:10cm×10cm(购至青岛海洋化 工);层析缸(可供放置硅胶板)与硅胶板配套;烘箱 (控制温度70℃和140℃);移液枪(10弘1)以及其配 套枪头;高速离心机;250ml具塞锥形瓶。 2.2 试剂 乙醇、正丙醇、乙酸、1一萘酚、磷酸,均为市售分 析纯。 2.3试剂的配制 展开液:正丙醇:乙酸:水一1:1:0.1; 显色液:准确称取1g1一萘酚于试剂瓶中,分别 加入100ml磷酸和900ml乙醇,用蒸馏水定容 至1000ml。 2.4测定步骤 2.4.1水苏糖和棉籽糖标样 购至sigma公司,也可用豆粕为原料按2.4.2 的提取方法。分别称取寡糖0.01g溶于体积分数 80%的乙醇溶液中,4。C保藏备用。 2.4.2样品的预处理 准确称取发酵豆粕样品2.5g于250ml三角 瓶中,加入25.0ml体积分数80%的乙醇溶液, 70℃水浴浸提1h。取2ml浸提液,10000r/m离 心10min,取离心后的上清液于4℃保藏备用‘“。 2.4.3样品的测定 在硅胶板底部用铅笔画一条直线(距离底部 1cm),根据样品的个数每隔一定距离点样,点样量 为5“l;点样干燥后将硅胶板底部置于装有展开液 的层析缸中进行展开(注意展开剂的液面高度不能 超过铅笔画的直线),当展开液前沿至离硅胶板顶部 约1C1Tt处时取出硅胶板。自然晾干后,用装有显色 液的喷雾器喷淋整个硅胶板,立即放人预先调好温 度为140℃的烘箱中烘至显色(约3~5min)。戴好 棉布手套,取出硅胶板,拍照保存图片。 2.5结果与分析 豆粕中的寡糖主要成分是水苏糖、棉籽糖和蔗 糖等,质量分数分别为4%、1%和5%。蔗糖是由 a—D一葡萄糖和B—D一果糖以a一1,2糖苷键结合而成。 而棉籽糖和水苏糖则是在蔗糖结构中的葡萄糖C6 位以u-1,6糖苷键又分别结合了1分子和2分子的 半乳糖,因此,蔗糖是二糖,棉籽糖是三糖,水苏糖是 四糖,它们都属于非还原性糖。 由于动物小肠黏液中缺乏a一半乳糖苷酶,水苏 糖和棉籽糖不被消化而直接进入大肠中,经肠道产 气微生物利用,产生气体,从而引起动物肠胃胀气或 腹疼现象。因此,豆粕中的这些寡糖也被称作胀气 因子或不良寡糖。 图5显示了采用TLC法定性豆粕样品中的寡 糖,分子量相同的寡糖与标样中的寡糖在硅胶介质 中迁移到同一水平位置上。 将市场上收集的不同厂家的发酵豆粕样品采用 TLC法检测不良寡糖的降解情况,结果见图6。 蔗糖 棉#F礓 水并,诱 1一寡糖柄 图5 精 耩 籽穗 算难 I 二 3 . j 6 7 8 0 1一豆粕;2-湖北某样品;3-广东某样品;4-上海某发酵蛋白; 5一山东某样品;6-上海某发酵蛋白;7-北某京样品j 8一浙江某样品;9-豆粕 图6不同厂家发酵豆粕样品中不良寡糖的TLC图谱 蒸鎏 万方数据 李旺军等:豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测/2013年一4期 从图7对比豆粕样品中的不良寡糖图谱可看出,2、 4、6、7号样品的不良寡糖降解非常彻底,表现为对 应豆粕同一水平位置的斑点消失;3、5号样品的不 良寡糖降解不完全,表现为除了豆粕中水苏糖、棉籽 糖和蔗糖存在外,在蔗糖的上面还多出了一个单糖, 这是典型的发酵不完全,仅进行了部分降解;8号样 品的不良寡糖基本降解,表现为水苏糖和蔗糖的斑 点亮度较弱,说明发酵不彻底。需要说明的是,水苏 糖、棉籽糖和蔗糖被微生物降解后会生成单糖,如果 它在样品中达到一定浓度,通过TLC法也能检测出 来,例如7号样品,不良寡糖降解非常彻底,但还有 部分单糖存在,这就是发酵的效果,说明寡糖经过发 酵后确实发生了降解,有生成的单糖为证。 为验证TLC法检测不良寡糖的灵敏性,用上海 某发酵蛋白样品和豆粕按照不同比例直接进行混合 后,检测其中的寡糖组成情况,结果如图7所示。 蔗糖1爹爹渗8 棉秆糟——{鍪 ‘ ’ 水苏穗——蔼謦 饕霸 l 2 3 t 0 b l一豆粕样品;2-上海某发酵蛋白;3-1份豆粕+1份上海某发酵蛋 白;4-1份豆粕+2份上海某发酵蛋白;5-1份豆粕+4份上海某发 酵蛋白;6-1份豆粕+10份上海某发酵蛋白 图7 发酵豆粕中掺入不同比例的豆粕后 不良寡糖的TLC图谱 从图7中可看出,上海某发酵蛋白样品的不良 寡糖完全降解;豆粕发酵蛋白中添加50%和33%的 豆粕后检测出来的TLC图谱与豆粕试验组基本相 同;随着豆粕掺入量的减少,寡糖斑点逐渐减弱;添 加量约为9%时,TLC法仍能检测出其中寡糖的存 在,说明TLC法具有一定的灵敏性。换言之,豆粕 完全发酵后寡糖降解很干净,发酵不彻底或掺人豆 粕通过TLC法同样能进行检测。 n5 3 小结 大豆抗原蛋白的检测方法主要有两种:(1)酶联 免疫法(ELISA):主要优点是定量分析,结果准确;但 是大豆抗体标样难以制取,操作复杂,检测成本高,一 般企业难承受;(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳法:用浸提 液将豆粕或发酵豆粕中的抗原蛋白提取出来,然后固 定到聚丙烯酰胺凝胶中,再用考马斯亮蓝对固定在凝 胶中的蛋白进行染色,对比豆粕和发酵豆粕样品中蛋 白条带的降解情况,直接判读抗原蛋白的降解效果; 其优点是定性检测,设备投资少,操作简单,检测结果 可直接判读。不良寡糖的检测方法有两种:一是高效 液相色谱(HPLC)定量检测,结果准确,但操作繁 琐,成本高,不推荐使用;另一是薄层色谱(TLC)定性 检测,主要原理是在展开剂的作用下,样品中的寡糖 在硅胶介质中的迁移速率不同从而被分开,由于寡糖 能与1一萘酚结合,在高温(140℃)下发生显色反应,通 过发酵前后样品对比即可判断豆粕中的不良寡糖是 否被降解;该方法设备投资少,操作简单,绝大多数公 司均能接受,而且结果可直接判读出来。 [参考文献] [1]张明峰,王立明.大豆中抗营养因子的研究概况[J].大豆通报, 1999(5):23—24. [2]曹钰,蔡国林,陆健.提高豆粕营养价值的研究进展[J].新 饲料,2007(6):13-15. [3]陆健.蛋白质纯化技术及应用[M].北京:化学工业出版 社,2005. [4]NaoyaK,HirokoI.Stepwiseextractionofproteinsandearbo— hydratesfromsoybeanseed[J].JAgricFoodChem,2005,53 (1):4245—4252. [5]刘欣,冯杰.大豆抗原蛋白的研究进展[J].中国饲料.2004 (20):14—15. [6]杨雅麟,王建华.张帆,等.薄层层析法分离菊芋汁中低聚糖 [J].理化检验一化学分册,2007,43(3),229—232. [7]方伟辉,华欲飞.大豆粕酒精可溶物的成分分离与鉴定[J].中 国油脂,2004,29(1):57—61. (责任编辑:苏幔) (上接第60页) 4 结论 免疫亲和柱层析净化结合高效液相色谱法测定 小麦中玉米赤霉烯酮,具有快速、准确、灵敏的优点, 可作为小麦中玉米赤霉烯酮定量测定的有效手段。 [参考文献] [1]张艺兵,鲍蕾,褚庆华,等.农产品中真菌毒素的检测分析 [M].北京:化学工业出版社.2006:279. [2]李军,于一茫,田苗,等.免疫亲和柱净化一柱后光化学衍 生一高效液相色谱法同时检测粮谷中的黄曲霉毒素、玉米赤霉 烯酮和赭曲霉毒素A[J].色谱,2006,24(6):58卜584. [3]罗小虎,包清彬,杨潇,等.高效液相色谱法测定玉米中玉米 赤霉烯酮[J].粮食与饲料工业.2009(3):48—49. [4]谢刚,兰盛斌,张华昌,等.免疫亲合柱在小麦真菌毒素检测 中的应用及毒素污染分析[J].粮食储藏,2004,32(6):37‘40. (责任编辑:俞兰苓) 万方数据 豆粕发酵蛋白中抗原蛋白和不良寡糖的检测 作者: 李旺军, 方华, 季春源 作者单位: 上海源耀生物科技有限公司,上海,201316 刊名: 粮食与饲料工业 英文刊名: Cereal & Feed Industry 年,卷(期): 2013(4) 本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_lsyslgy201304017.aspx
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