实验一 DNA的定量测定

nullDNA的定量测定——二苯胺法DNA的定量测定——二苯胺法生物化学实验实验目的及要求实验目的及要求学习分光光度计的原理和操作技术 掌握二苯胺显色法测定DNA的原理和方法 掌握DNA纯度的测定方法实验原理实验原理 脱氧核糖核酸被酸或碱水解后脱氧核糖可以与二苯胺反应，生成蓝色化合物，在595毫微米处有最大吸收。在每毫升含20到200微克DNA范围内，光密度的读数与DNA的浓度成正比，可以用比色法测定。核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋白质，由于蛋白质在280 nm处具有强吸收峰，因此测定A260/A280比率，可以判断DNA的纯度。纯化的DNA及RNA的A260/A280 比值应分别接近1.8 及2.0，当溶液中含有蛋白质时，会造成A260/A280 比值降低。 实验仪器实验仪器7200型分光光度计和紫外可见分光光度计 吸管 试管 恒温水浴锅 坐标纸 移液器 null恒温水浴锅nullnull实验试剂实验试剂1. DNA标准溶液(200ug/ml)：取DNA钠盐用5mmol/l的氢氧化钠配成200微克/毫升的溶液。 2. 二苯胺试剂：称取纯二苯胺1克，溶于100毫升纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R，60%以上），混匀，待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液。棕色瓶储存， 3.粗制DNA样液实验步骤实验步骤1.标准曲线的制定：取6支试管，编号为0、1、2、3、4、5，分别加入0，0.4、0.8、1.2、1.6、2.0毫升DNA标准溶液，再分别添加蒸馏水，使其体积都为2毫升，然后各加入4毫升二苯胺试剂，混匀。于60℃恒温水浴中保温1小时，冷却后，选595nm波长，以0号管为对照，于7200型分光光度计上进行测定，以光密度对浓度作图，制定标准曲线。 2.制品的测定：取一支试管，加入待测液2毫升和4毫升二苯胺试剂，摇匀。以下操作与标准管相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当于该光密度的DNA含量，并按下式计算出制品中DNA的含量。 　　　　　　　 nullnull3. 作标准曲线求值（DNA样） 4. 取600ul待测液放在1cm的石英比色皿中，加水稀释5倍，以水为对照，测A260和A280。 5. 计算A260/A280值，判断其纯度思考思考题 二苯胺法测DNA分子中的什么成分？显色反应的最大吸收波长是多少？显色反应在什么温度下进行，需要多长时间？比色时为什么用空白试剂校零？