单克隆抗体的制备

A 抗体制备技术 抗体制备技术 1、多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物～。 2、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。      抗体制备技术 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的纯化 （四）免疫血清的鉴定 （五）免疫血清的 二、单克隆抗体制备 （一）单克隆抗体制备原理 （二）单克隆抗体制备的技术要点 （三）影响杂交瘤技术的因素 （四）单克隆抗体的应用 三、基因抗体技术 （一）人源化抗体 （二）小分子抗体 （三）双特异性抗体 （四）抗体库技术 一、多克隆抗体制备 （一）免疫原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天然抗原、人工或合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；具体制备—细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原性抗原和免疫佐剂～ 1、细胞性抗原制备：    绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素；    细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清） 2、可溶性抗原制备：    指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化～ 1）细胞的破碎（物理法、化学法） 2）提取与纯化： ①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。 ②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境～例50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；8%～12%PEG 6000可沉淀IgG～。         盐析法沉淀抗原的机理 ③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛～ ④层析法—包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的精提～ ⑤电泳——（略） 3）鉴定：      鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、      纯度以及免疫学活性。 凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理 亲和层析的作用机理 3）鉴定：      鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、      纯度以及免疫学活性。 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳、高效液相层析 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹 Westernblot鉴定三株单抗的特异性 1.分子量标准；2.阴性对照:正常小鼠血清；3.纯化后的B6与病毒上清反应；4.纯化后的G12与病毒上清反应；5.纯化后的2B12与病毒上清反应。 3、半抗原性免疫原的制备         半抗原（hapten）～         蛋白质等载体（carrier）～         连接—物理法：即利用电荷和微孔吸附半抗原         化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分子上 4、免疫佐剂（immunoadjuvant），佐剂    指某些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。    种类—无机、生物性、人工合成、油剂和纳米颗粒。    用途—抗原表面积增，构型改变；延长抗 原的滞留时间；增强吞噬～ （二）免疫动物 1、免疫动物的选择：   ①抗原来源与动物种属的关系（越近越差）  ②动物个体的选择（年龄、体重与健康，）  ③抗原性质与动物种类 2、免疫的方法：    免疫原的剂量～    免疫的途径与其间隔时间～    免疫动物采血～  （对实验成功与否至关重要） （三）免疫血清的纯化 1、特异性抗体的纯化 1）亲和层析 2）吸附 2、IgG类抗体的纯化 1）盐析 2）凝胶过滤 3）离子交换 4）亲和层析 (四)免疫血清的鉴定 1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA） 2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散） 3、纯度的鉴定（SDS-PEAG） 4、亲和力的鉴定—affnity指抗体与抗原结合的牢固程度，以亲和常数表示。测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非竞争）结合等。   单抗亲合常数的测定： 单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法： 1）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和； 2）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作为OD-100，找出OD-50时的抗体浓度和相应的pp65抗原浓度； 3)根据公式计算McAb的Ka值。 t代表测定时的温度； n=[Ab]t/[Ab’]t； [Ab]t表示抗原浓度较高的Amax的一半； [Ab’]t表示抗原浓度较低的Amax的一半。 对于单克隆抗体，一般亲合力要求>107L/mol，好的单抗多大于109 L/mol。 （五）免疫血清的保存 1、4℃保存（6个月） 2、低温保存（-70 ℃ ～-20 ℃ ，5年） 3、真空干燥保存（5 ～ 10年） 注意点：保存前需经除菌         保存液含防腐剂         避免反复冻融（分装）         二、单克隆抗体制备 单克隆抗体（monoclone antibody，McAb）是由抗原致敏的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一抗原决定簇的纯的抗体。 其理化性状高度均一，生物活性单一，高度特异及高效价特性，用于临床实验室诊断与临床疾病治疗。 （一）单克隆抗体制备的原理 利用杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 即致敏B淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具无限繁殖能力，从杂交瘤中经克隆化后成为单个细胞克隆并分泌抗体，称为单克隆抗体。 制备过程—致敏B淋巴细胞（免疫动物）        杂交细胞瘤制备、筛选        杂交瘤细胞分泌抗体的确认        分泌抗体的杂交瘤细胞克隆        单克隆抗体的批量生产 （二）单克隆抗体制备的技术要点 1、免疫动物选择纯系Balb/c小鼠 2、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选 3、细胞融合 4、阳性克隆的筛选 5、克隆化 6、单克隆抗体的制备 7、单克隆抗体的纯化和鉴定 8、单克隆抗体的保存 （三）影响杂交瘤技术的因素 1、试剂与器材   用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂 2、培养技术   防止污染，细胞培养的娴熟技能～ 3、早期克隆化   避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免克隆细胞的丢失。 （四）单克隆抗体的应用 1、医学检验诊断试剂    利用单抗具有的特质-特异性与纯度高，理化性均一～ 2、蛋白质的提纯    将其作为亲和层析中的重要配体～ 3、肿瘤的导向治疗协助示踪    三、基因工程抗体技术 基因工程抗体（genetic engineering antibody）又称重组抗体，指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。 包括：（一）人源化、小分子、双价特异及抗体融合蛋白等。             （二）抗体库技术 （一）人源化抗体（humanized antibody） 人源化抗体指将鼠源性单抗，通过基因克隆和DNA重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基酸序列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性与特异性，但降低鼠单抗的异源性利于人体内使用。 1、嵌合抗体（chimeric antibody） 2、改形抗体（reshaped antibody） （二）小分子抗体 小分子抗体指相对分子质量比较小但具有抗原结合功能的分子片段～。 小分子抗体：抗原结合片段（Fab）、可变                         区片段（Fv）等～ 优点：分子小，通透性强               原核细胞表达，成本低               不含Fc段，不与带Fc段受体反应               半衰期短，利于及时清除                         （三）双特异性抗体 双特异性抗体(bispecific antibody)又称双功能抗体。他具有针对两个不同抗原位点结合的特性，可同时与两种不同抗原发生结合，不同于天然抗体。 1、化学交联～ 2、细胞工程～ 3、基因工程～ （四）抗体库技术 抗体库技术是指用细菌克隆代替B细胞克隆来表达制备各种抗体（抗体谱）。    噬菌体展示(phage display)，即用分子克隆的方法将外源基因片段插入噬菌体壳蛋白的非必需区，该基因的表达产物与壳蛋白一起以融合蛋白的形式展示于噬菌体颗粒的表面。 （四）抗体库技术 主要特点： ①简单快速（无须细胞融合） ②选择范围广 ③可模拟体内免疫系统反应 ④可直接获得特异性人抗体 ⑤规模生产方便 1单克隆抗体的制备 （一）杂交瘤细胞的大量繁殖     克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖，直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的100~1 000倍。     利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。     1．材料 　（1）经高压灭菌的降植烷。 　（2）Balb/c鼠：5~8周龄。     （3）杂交瘤细胞：取对数生长期的细胞。     （4）RPMI—1640培养液     （5）新生牛血清     2．操作方法 　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周内种植细胞。 　　(2) 收取对数生长期的杂交瘤细胞，用５％FCS—1640液洗涤一次，1 000r/min离心10min。     (3) 取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107细胞/ml的悬液。     (4) 给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107个细胞/ml）。     (5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。     （二）单克隆抗体的提纯     1．材料     (1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液       20 mMol/L NaCl     (2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液       40mMol/L NaCl     (3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液       80 mMol/L NaCl     (4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液     (5) 饱和硫酸铵液     (6) DEAE—纤维素柱                    一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。     （8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。     样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。     测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。     杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。     （三）单克隆抗体的鉴定     1．杂交瘤细胞染色体的检查  采用秋水仙素裂解法进行。     2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。     3．单抗的特异性鉴定  可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。     4．单抗的效价测定  可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。 5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。 2抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 　　免疫细胞化学的 技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 项目 常规免疫血清抗体 McAb 抗体产生细胞 多克隆性 单克隆性 抗体的结合力 特异性识别多种抗原决定簇 特异性识别单一抗原决定簇 免疫球蛋白类别及亚类 不均一性，质地混杂 同一类属，质地纯一 特异性与亲合力 批与批之间不同 特异性高，抗体均一 有效抗体含量 0.01～0.1mg/ml（小鼠腹水） 0.5～5.0mg/ml(小鼠腹水) 0.5～10.0μg/ml（培养物上清液） 用于常规免疫学实验 可用 单抗组合应用 抗原抗体形成格子结构（沉淀反应） 容易形成 一般难形成 抗原抗体反应 抗体混杂，形成2分子反应困难，不可逆 可形成2分子反应，可逆 　　单克隆抗体的制备方法如下。 　　（一）动物的选择与免疫 　　1．动物的选择 　纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 　　2．免疫 　　选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） 　　↓3周后 　　第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） 　　↓3周后 　　第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） 　　↓2～3周 　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） 　　↓3天后 　　取脾融合 　　目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 　　（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 　　初次免疫 1×107/0.5ml ip 　　↓2～3周后 　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip 　　↓3周后 　　加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv 　　↓ 　　取脾融合 （二）细胞融合 　　1．细胞融合前准备 　　（1）骨髓瘤细胞系的选择： 骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。 表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系 名 称 来 源 耐 受 药 物 Ig链 H L P3/X63-Ag8(X63) BALB/C骨髓瘤MOPC-21 8-氮鸟嘌呤 r1 　K P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) P3/X63-Ag8 8-氮鸟嘌呤 － － P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1) P3/X63-Ag8 8-氮鸟嘌呤 － K（不分泌型） P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul) （X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤 8-氮鸟嘌呤 － － SP2/0-Ag14(SP2/0) （X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤 8-氮鸟嘌呤 － － F0 BALB/C骨髓瘤 8-氮鸟嘌呤 － － S194/5.XXO.BU.1 P3/X63-Ag8 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 － － MPC11-45.6TG1.7 BALB/C骨髓瘤MPC-11 6-巯鸟嘌呤 r2b 　K 210.RCY3.Ag1.2.3 LOU大鼠骨髓瘤R210 8-氮鸟嘌呤 －　 K GM15006TG-A12 人骨髓瘤GM1500 6-巯鸟嘌呤 r1 　K U-266AR 人骨髓瘤U-266 8-氮鸟嘌呤 ε　　λ 　　骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 　　（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。 2．细胞融合的步骤 　　（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。 　　与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周        ↓ 　　拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min 　　↓ 　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 　　↓ 　　用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管） 　　↓ 　　反复冲洗，吸出冲洗液 　　↓ 　　冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min 　　↓ 　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml 　　↓ 　　加入96孔板，100μl/孔 　　↓ 　　放入37。c CO2孵箱培养 　　（2）制备免疫脾细胞 　　最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死 　　↓ 　　无菌取脾脏，培养液洗 一次 　　↓ 　　脾脏研碎，过不锈钢筛网 　　↓ 　　离心，细胞用培养液洗2次 　　↓ 　　计数 　　↓ 　　取108脾淋巴细胞悬液备用 　　（3）制备骨髓瘤细胞 　　取对数生长骨髓瘤细胞离心 　　↓ 　　用无血清培养液洗2次 　　↓ 　　计数，取得×107细胞备用 　　（4）融合 ①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 　　②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。 　　③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。 　　④离心，800rpm, 6min。 　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。 　　⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。 　　⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。 　　（三）选择杂交瘤细胞及抗体检测 　　1．HAT选择杂交瘤细胞 　　　脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。 　　在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。 　　2．抗体的检测　　 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。 　　常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。 （四）杂交瘤的克隆化 　　杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。 　　1．有限稀释法克隆 　　（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。 　　2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。 　　（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。 　　（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。 　　（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。 　　（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。 　　（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。 　　（8）每个克隆应尽快冻存。 　　2．软琼脂培养法克隆 　　（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。 　　①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。 　　②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。 　　（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。 　　（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。 　　（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。 　　（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。 　　（6）4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。 　　（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。 （五）杂交瘤细胞的冻存与复苏 　　1．杂交瘤细胞的冻存　　 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。 　　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。 　　细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。 　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 　　2．细胞复苏方法 　将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。 　　（六）单克隆抗体的大量生产 　　大量生产单克隆抗体的方法主要有两种： 　　（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。 　　（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。 　　①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。 　　②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。 　　（七）单克隆抗体的鉴定 　　对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定： 　　1．抗体特异性的鉴定 　　除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。 　　2．McAb的Ig类与亚类的鉴定　　一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。 　　3．McAb中和活性的鉴定 　　　用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。 　　4．McAb识别抗原表位的鉴定　　用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。 　　5．McAb亲合力的鉴定　 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。 3单克隆抗体的制备及应用 一、单克隆抗体概念： 每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、 组成均一、 只与同一种抗原决定族反应的抗体， 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。 二、杂交瘤技术制备单克隆抗体 三、单克隆抗体的基本技术 1.抗原提纯与动物免疫： 抗原纯度高：电泳纯 与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠 2.细胞的选择：    A 经过抗原免疫的B细胞（脾细胞）。    B 肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0）。 3.细胞融合：    融合剂：聚乙二醇      (PEG,常用聚合度1000~2000浓度w/v：40%)    细胞比例：   1:2~1:10，常用1:4。    反应时间：2~4min。 4.培养基的选择：HAT培养基。含有三种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T). 5.细胞的DNA合成一般有两条途径： A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与反应。 B：在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化下合成DNA。 6.  HAT培养基的选择原理：   ⑴ 氨甲蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。   ⑵ 瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。   ⑶ B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降)。   ⑷ 融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。 7. 克隆化并扩大培养(单细胞培养称为克隆化)： ⑴有限稀释法:将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔(36%的孔为1个细胞/孔)，可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。 ⑵显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。 ⑶软琼脂平板法：下饲养/上融合C,分层培养后用⑵法 ⑷细胞分选仪法：流式细胞仪分选。 8. 单克隆抗体的制备、纯化： A   体外细胞株扩大培养，取上清液提纯。 B   接种小鼠腹腔，取腹水提纯。 C   纯化按抗体纯化步骤进行。 9. 细胞株冻存和复苏：加小牛血清或1640培养液配成终浓度10%的二甲亚砜(DMSO)冻存液后液氮(-196 ℃ )保存。原则是：慢冻(逐步降温，以每分钟降1℃为宜)，快融(立即浸入37~40 ℃ 水浴)。 10.注意事项： ⑴ 用降植烷(pristane)等油类制剂，反复注入BALB/C小鼠腹强腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞。这种细胞在适宜培养条件下，具有无限繁殖能力，选择本身不会产生Ig (SP2/O和小鼠骨髓瘤653细胞株)的对数期生长细胞作为融合细胞。 ⑵选择缺乏HGPRT或TK的细胞：    A  采用毒性药物8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)选育出缺乏HGPRT的细胞(因为缺乏HGPRT+细胞利用8-AG后合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT+ 细胞才能存活），培养过程中有个别细胞出现返祖现象，故应定期用15~20ug/ml的 8-AG处理细胞。 B 或利用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BudR)诱发缺乏TK的细胞。一般选育缺乏TK的细胞较困难。 ⑶采用饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一定量的其他活细胞后，常可促进原有细胞的繁殖，这种加入的细胞即称为饲养细胞，可用普通小鼠脾细胞/腹腔细胞/胸腺细胞、大鼠和豚鼠的腹腔细胞，最常用普通小鼠腹腔细胞。 三、单克隆抗体的应用： 1.诊断(检测)试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等 2.治疗： A 移植物受者使用T细胞的McAb，可预防急性排斥反应。 B 供体骨髓在体外经T细胞的McAb处理，可减轻或消除移植物抗宿主反应。 C AIDS治疗 D 肿瘤介入治疗：细胞毒剂(药物)与抗肿瘤抗原的McAb结合后，利用McAb的导向作用，将细胞毒剂(药物)定位于肿瘤细胞，到达直接杀死肿瘤细胞的目的。 _1234567890.bin _1234567891.bin