动物病毒在细菌中的繁殖

动物病毒在细菌中的繁殖美国贝勒医学院的病毒学家oJ阳phL.Mel颐血教授,应上海市微生物学会邀请,于1979年4月作了学术报告,介绍了病毒学中的一个重要进展,原题为“动物病毒在细菌中的繁殖”,现刊出根据录音和记录的整理稿,供读者参考。—本刊编挥组动物病毒在细菌中的繁殖是病毒学中一个很新的发展,这将改变整个过去进行病毒工作的途径。过去我们对病毒工作的概念或途径是从分析的角度来研究,分析是什么病毒,以及它们如何复制。现在从合成的角度来研究病毒,可以根据需要制造病毒,可以将病毒加到从未接触过这种基因的活细胞中,让它们产生对人类有用的物质。病毒可分为DNA和RNA病毒。DNA病毒,包括疤疹病毒、腺病毒、痘类病毒、乳多空病毒和微小DNA病毒等。RN八.病毒,包括副粘病毒、麻疹病毒、流感病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒、小RNA病毒及环状病毒等。病毒的形态和大小虽有不同,但它们都按两个原则来组成的:所有的RNA病毒都有一个带有蛋白质和RNA的核心。小的病毒只有一个RNA片段作为基因组,但大的病毒如流感病毒就有几个基因片段。有的有脂蛋白外膜,带有一些面抗原,如流感病毒。典型的DNA病毒,以疤疹病毒的结构为例,它的中心也是核酸,外面有结构蛋白衣壳包围着,它们中有的还有包膜如疤疹病毒,有的没有包膜。首先复习病毒的增殖过程,这过程对动物的、细菌的或植物的病毒都是如此。先看细菌病毒增殖过程:首先病毒吸附于细胞表面,然后把其核酸注入细胞,很快在细胞内出现一种早期蛋白,以后晚期基因发挥作用,合成晚期蛋白,即病毒的结构蛋白。几乎同时病毒的基因组也出现了,这一时相称为隐蔽期。尽管已知有新病毒成份在合成,但并无新病毒形成,病毒的装配是在此循环的最后一部分进行的,此时出现成熟的病毒,同时细胞破裂,释放病毒颗粒。上述增殖过程是以分钟来计算的,全过程约一小时左右。动物病毒增殖的过程与细菌病毒几乎一样,只是有几点稍有不同。其一是每期的时间不是以分钟计,而是以小时来计算的。脊灰病毒从开始到终了约6小时,疤疹病毒约18小时,但它们的表现相似。此外,动物细胞膜和细菌壁显著不同,它不象细菌壁那样坚固,无需注入过程。病毒接触于细胞膜上,膜凹陷而包着病毒,在细胞内酶的作用下,病毒颗粒的外衣被脱去,释放核酸,病毒核酸在细胞中出现,如前所述:早期蛋白的合成,病毒结构蛋白及核酸的形成,即隐蔽期。在隐蔽期终了时,在细胞内出现成熟的病毒,但不释放,在这时细胞常常死亡,但也不一定完全如此,一因为也可能建立这样的一种细胞培养,在这培养中所有这些病毒增殖的过程发生在很低的水平上,病毒持续不断地释放,特别象病毒引起的肿瘤那样,细胞可以存活并可分裂,持续很长时间,在释放病毒时并不引起细胞的死亡,在此过程中病毒的一23一释放量达到惊人的程度。近年来发现细菌中有限制性内切酶。当外来核酸进入菌体,这种酶一、可以使它分解,所以这种酶对细菌有保护作用,因大部分病毒进入细菌细胞后,其核酸被限制性内切酶切断,病毒就不能在细菌中增殖。当细菌缺乏能切断某种病毒核酸的内切酶,该病毒进入菌体就可以增殖并杀死细菌。某株细菌总是对某种病毒起作用,这成为这种酶命名的依据,细菌被认为是限制性或非限制性,是指细菌病毒能否在其中生长而言。现在已清楚“限制性”是酶能识别特定的DNA顺序的结果,这种识别DNA分子中某顺序的能力与DNA的来源无关,现在可以用这些酶对细菌及动物的核酸进行加工。限制性为切酶的一个显著的特点是它们在切割核酸付,并不把它们切到很小的分子,而只在固赵的特殊的位点上把核酸切开。如果某核酸.上有一个这样的位点,就被切为两段,如果有10个位点就被切为n段。其结果是非常特异的,用同一种酶对同一种核酸起作用,切下的片段永远是一样的。已发现用内切酶能把DNA分子切成片段,人们可以把这些片段的排列次序搞清,从而对整个DNA分子的基因排列进行研究。不同的细菌有不同的限制性内切酶,所以人们可以得到一系列可以在不「弓位置切割核酸分子的试剂,并用这些内切酶来分离提纯不同的基因。有了这些不同的墓因片段,就可以研究它们的结构和功能的不同点。这些内切酶的应用主要在两个方面。一个是在大的复杂的DNA基因组中,把基因的顺序排出来,另一为基因工程,将某一特殊基因与一快速复制的DNA偶联,这DNA可以是细菌的DNA、病毒的DNA或质体DNA。得到重组DNA后就可以把它插入细菌体中,随细菌增长,很快可得到大量新的基因,美国正在作这方面的工作,但控制的条件是很严的,因为所有的细菌都可用于这项工作,必须注意用于这项工作的细菌在一般的条件不能生长。例如采用一个含有肿瘤病毒的大肠杆菌,如有人感染了这种有肿瘤病毒的细菌,那就会发生危险。为此,这种工作必须限定在严格限制的条件下进行。这个技术的进行依赖于上述限制内切酶,举例:一个病毒的DNA和细菌质粒DNA用内切酶进行切割,两种核酸对称地一叨断,然后用从细菌提取的连接酶使裂口的两个断端连接起来,这时病毒的核酸和自己的残端相连又形成原来的病毒,或者两种核酸互相连接形成杂交的重组DNA,把这种杂交DNA植入细菌,在细菌繁殖时所得的细胞中含有包括重组DNA在内的核酸。以下所述工作的目的有两个:一个是看动物DNA能否在细菌中生长,另一目的是看细菌把多瘤病毒带入宿主能否引起肿瘤或其他改变。实验的是多瘤病毒DNA插入大肠杆菌,再接种小鼠,观察小鼠是否感染。在大肠杆菌多瘤病毒的基因工程中用两种限制性内切酶:用大肠杆菌产生的ECoRI切断多瘤病毒核酸中的早期区,用BoHl切晚期区。切断了早期区则影响早期蛋白和酶的形成过程,此时晚期区不受影响。如切断了晚期区则影响晚期,而不影响早期区。多瘤病毒的分子量约3,400,000,细菌质体分子量约2,600,000,重组后的分子量约6.OXI护。在此实验中两种核酸等量放在一起,用内切酶把它切断,加热使酶失活,然后再以另一来源的连接酶,使之连接,这样90%所得的核酸的分子量为6.0x10“,而且所得的质体比原来的质体大得多。用新的质体感染细菌,在300个大肠杆菌集落中查得有7个含有多瘤病毒的整个DNA,以上是用E伪Rl切开早期区后进行的试验。如用BamHl切开晚期区进行类似的试验,结果在200个集落中有9个含有多瘤病毒的DNAo从这些生长的细菌中分离出的核酸分子量为6x106,与原杂交DNA分子量相同,而且再用同样的内切酶处理还可解开为两个部分,一24一一个分子量为2.6X106,另一个是3.4K106。从大肠杆菌中繁殖后分离的核酸的电泳图谱可见,重组后的核酸与原来的多瘤病毒DNA位置相同,而与质体DNA不同,用8v4。病毒作为各线条位置的对照。也可用标记物处理后观察杂交的DNA的来源。1776号是一特殊的大肠杆菌,它只有在一定的化合物存在的情况下才能生长,它的核酸不与质体DNA或多瘤病毒DNA杂交,如果用这种特殊的质体DNA感染大肠杆菌,增殖后提取DNA标记后,查见它只能和原质体DNA杂交。从4个杂交DNA克隆所提取的DNA,可以同质体D入人也可和多瘤病毒DNA进行杂交,说明多瘤病毒DNA已插入质体DNA。在细菌中生长的多瘤病毒DNA的功能怎样呢?用从克隆的菌中提取的多瘤病毒DNA,接种于小白鼠,这些多瘤病毒DNA有的早期区完整,有的是晚期区完整,然后用测多瘤病毒抗体的方法来检查是否有感染,正如肝炎那样,如有感染会产生抗体,如没感染就没有杭体存在。结果四个克隆试验均无抗体产生。如果把环状DNA用内切酶切开成线型,分子量相同,均为600万,但环状的用5微克也无感染性,而线型的从4个克隆的大肠杆菌的结果DNA用量0.25微克均产生抗体,与对照相近,对照是用多瘤病毒DNA0.1微克,10只小鼠中有9只感染,盐水对照为9只中0只。环状的无感染性,而线状DNA有感染性,因为小鼠体内缺乏打开环状DNA的机制。把含质体和多瘤病毒重组基因的大肠杆菌,注入小鼠(腹腔、皮下或口服),结果均未感染。因这些大肠杆菌不是正常的,而是有缺陷的大肠杆菌,它们不易在小鼠体内生长,故这些实验没有太大的意义。另一实验是把完整的或线型的含多瘤病毒和质体的重组DNA引入组织培养,用对多瘤病毒特异的血凝反应查看是否感染,结果完整的环状重组DNA并不引起血凝抗体,而如前所述切断后的线状DNA可全部引起血凝阳性反应,说明大量细胞被多瘤病毒所感染。为了要确证组织培养中复制的是多瘤病毒,把病毒从组织培养中提取出来,用限制性内切酶与组织培养中提取的病毒DN人反应,对这些分子进行电泳分析,这种分析是测定病毒基因中最敏感的方法。结果,从组织培养中得到的含多瘤病毒的DNA与接种进去的母代含多瘤病毒的重组DNA相同。上述这样敏感的测定基因的方法可用于疤疹病毒的传染流行病调查中。如有某人得疤疹感染,其他人和他接触也感染了,如果病毒是同一来源,用内切酶作用后核酸的电泳图是一样的,如不是同一来源也可显示差别来。上述的实验中说明了从细菌所得多瘤病毒核酸与母代相同。以上实验是很重要的,因为照此可把真核细胞的核酸引入原核细胞中去,而细菌并不认识这是外源性动物核酸,把它当成自身的核酸进行繁殖。以上所述是一种以细菌质体为载体的实验,除此以外也有用其他载体的,例如,大肠杆菌入(L田对以玩)噬菌体,这里又可把多瘤病毒的DNA插入到大肠杆菌入噬菌体的核酸中,这是一个很有用的工具。开始时先把入噬菌体的核酸切去一段,它就失去了感染大肠杆菌的能力。然后多瘤病毒的核酸用内切酶切割后,分子量相当于上述缺口的一段,用连接酶连接后,入噬菌体又恢复了感染性,种入细菌可引起空斑。在实验中入噬菌体的DNA可分出长的和较短的共两段,长的一段是入噬菌体的DNA,短的多瘤病毒的DNA,还有另一种两段DNA差不多长,一段是入噬菌体的DNA,另一段是两个多瘤病毒的DNA连在一起,其长度是单体(1:8微米)的二倍为3.6微米,这样就和入噬菌体的DNA差不多长。通过超离心,含核酸少的分子量少,就在顶部,底部分子量大就是含多瘤病毒双体的重一26一组DNA。把含这两种D五A的入噬菌体接种大肠杆菌,并进行传代,烤果用含多瘤病毒单体重组DNA者,复制出也都是含单个多瘤病毒的,而用后者则可得含一个或二个多瘤病毒DNA的重组DN诱分子。把上述得到的这些物贡注入小鼠,观察其感染性。把未经内切酶作用的入噬菌体和多瘤病毒重组的DNA给小鼠注入,剂量高到1.43微克/小鼠,或稀释100倍都不引起感染。同上重组DNA用EO)RI切后不但高浓度有感染性,就是低浓度也有感染性,几个不同的克隆的结果都是如比,只有用内切酶切成线状的DNA才有感染性,而且其感染性和多瘤病毒本身的DNA强度差不多,大肠杆菌或入噬菌体中的环状重组DNA都没感染性,要在某特定点上切开后才有感染性。以上所述为用含单个多瘤病毒DNA的重组DN’A的感染性情况,下面是观察含多瘤病毒DNA双体的重组DNA感染小鼠的情况。用含这种DNA的活菌皮下注射或口服都不会引起感染,但从其中提取的含双体的重组DNA未经切开有感染性,23微克可使5个小鼠感染2个。直接用噬菌体或从其DNA(含双体多瘤病毒核酷…的重组DNA)均可引起感染。用含单个多瘤病毒的重组DNA的细菌或噬菌体和前面所述情况相同,并不引起感染。单纯多瘤病毒的DNA只要0.01微克就可感染,这个剂量较含多瘤病毒双体重组DNA要少得多。但是上述结果仍有其重要意义,这是首次用动物病毒核酸通过噬菌体可使动物发生感染。这工作在美国国家卫生研究院还在进行中,正在观察田鼠是否可被这些感染后发生肿瘤,因为田鼠是对多瘤病毒最敏感的动物,还要等半年到一年才能看到结果。用多瘤病毒体进行感染,腹腔注入只需100到1000个多瘤病毒DNA分子就可引起感染,而口服需105~1护。从病毒体中提取的DNA不论是卷曲状或展开型的环形分子,要10.左右腹腔注射才能引起感染,这些环形DNA用ECORI或BamHl切开成线状后也是需10吕~10,能引起感染。与质体DNA结合单个多瘤病毒DNA克隆以后,活的大肠杆菌1776号或质体DNA不能引起感染,而经内切酶切开的质体DNA就有感染性,其感染剂量与从病毒体提取的DNA相近,都是10。左右。引入含多瘤病毒DNA单体重组DNA的克隆入噬菌体,不论是在潜伏期的活大肠杆菌中,细胞的DNA,提纯的噬菌体,或从纯化的噬菌体中提取的DNA均无感染性,而只有当此纯化的DNA用限制性内切酶切开后才有感染性。而当用2个多瘤病毒的DNA与一个质体DNA结合后,把这含双体的重组DNA引入噬菌体,在其中的克隆的结果就不同,潜伏期的活大肠杆菌无感染性,但是细胞DNA,纯化的噬菌体以及从纯化噬菌体中提取的DNA,不需内切酶切开就有感染性,感染剂量为10,~101`,这类工作还刚开始,正在进行中。在其他系统中如何应用上述结果?其中一个问题是对中国病毒学工作者特别感兴趣的,即肝炎基因组如何插入细菌中。乙型肝炎病毒经提纯后在电镜下可看到湘毫微米球形颗粒,这种颗粒不含核酸也不能复制。还有丝状颗粒和有双层外衣的Dane颗粒。Dane颗粒中有DNA,可把它提纯出来引入大肠杆菌。乙型肝炎病毒的核酸是环状的双股DNA,它的内圈有时是不完整的,故有的环状DNA完全是双股的,有的其中有一段单股。肝炎病毒的核酸也可用上述用于多瘤病毒的限制性内切酶EoCRI切割后,插入媒传体噬菌体,通过植入大肠杆菌,让它增殖。把DNA从细菌中提取出来进行电泳,象多瘤病毒重组DNA的电泳,可观察到比重组前入噬菌体的DNA多一个多瘤病毒的成份。乙型肝毒的实验与多瘤病毒相似,把乙型肝炎病毒核酸与入噬菌体的DNA重组,也有一26一一个长段DNA和一个短段的DNA,长的是入噬菌体的核酸,短的是乙型肝炎病毒的核酸。有时也有较大的分子,含有乙肝DNA双体,这与多瘤病毒双体的情况很相近,是两个乙型肝炎病毒核酸分子与一分子入噬菌体DNA相连。除此以外,新近疤疹病毒DN’A也可进入相同的媒传体入噬菌体系统中。疤疹病毒的DNA大而复杂,其分子量为100x10`,分成长段分子量80x106和短段20x106,这样大的核酸编码出的蛋白质有40多种。这核酸在限制性内切酶作用下可切成一些不同的片段,经分离后把某段插入噬菌体所缺DNA的缺口上。一如取一段疤疹病毒胸腺嗜吮激酶的编码DNA(胸腺哦吮激酶是疤疹病毒复制中必需的),在这样编码的DNA插入入噬菌体后,在入噬菌体中就有一段核酸编码为“疤疹病毒胸腺嗜吮激酶”。目前制备乙型肝炎疫苗是从表面抗原携带者取得抗原,这些人体内有病毒增殖,故做成疫苗时必须十分注意不要把有感染性的材料注入接受疫苗的人。因为乙型肝炎病毒的核酸很长,现在可以取一段表面抗原编码的DNA插入到入噬菌体的DNA中,如可复制并形成HBaAg而没有感染的成份,如能成功,就不需用黑猩猩进行安全试验了。另一方面的展望是合成基因。如果已知某蛋白质的氨基酸顺序,就可以知道相应的DNA基因的结构,胰岛素的合成就是这样做的。胰岛素有两条链,A链和B链,它们的结构都已搞清,现在用人工合成DNA的方法接种大肠杆菌使其产生A、B链,目前已做到从然克湿大肠杆菌细胞中,可合成出10毫克胰岛素。报告人在巴黎见到一只瓶子里的乙型肝炎病毒核酸的量相当于100升含多量D二颗粒的血浆中提出的量,但这仅仅只经过一夜的大肠杆菌培养物。乙型肝炎表面抗原直径为朋毫微米,把它分到分子量为22,000的多肤,证明是有效抗原成分。再进行分割,最近证明起决定性作用的抗原分子量为6000,这就可以用合成基因方法来使细菌生产它,如果成功的话,这将是第一次人的疫苗可用细菌来制备。这是一条好的途径,如果世界各地的病毒实验室都注意并进行有关这方面的工作,预期它是会成功的。正象早期人们想登月一样,那时确信这是可能的,但很难,要仔细地研究工程方面的细节。这与用细菌来进行人类疫苗生产一样,是有可能的。〔上海生物制品研究所何葆光整理〕一27一