第三章 细菌的生长和遗传变异

第三章细菌的生长和遗传变异提纲生长细菌群体生长测定方法（数量、重量）间歇、连续式培养—生长曲线（数量或重量）遗传与变异分子机制应用—细菌筛选与驯化(基因法菌种改良)第一节细菌的生长及其特性 生长——细菌群体数量的增长，不是个体体积的增长。 提问：为什么这里不考察细菌个体的生长呢？ 个体太小，难观察计量 群体细菌对环境产生影响 各类细菌都是倾向于群居（物以类聚） 提问：弱势生物的群居优势是什么？ 生存状况提高，攻防具佳 （攻）群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌，（防）群居的细菌不易被天敌伤害，还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，可有性生殖； 团结就是力量 细菌群体力量改变环境 通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细菌群体的生长规律——“生、老、病、死”。 外界因素引起的细菌数量的增加、停滞、衰减等变化。 提问：如何研究呢？ 测菌数量变化与外因的关系 提问：细菌群的“生、老、病、死”表现为何呢？一、细菌生长（数量）测定方法 （1）直接计数法 借助显微镜观察测定 优点：快速 提问:有哪些缺点? 缺点：不能区分细菌的死活 分四种1.涂片染色法1视野菌液(ml)＝(0.01ml／1cm2)*视野面积(cm2)0．01ml菌液均匀涂布，染色面积1cm2计数每个视野细菌的平均数量细菌数量=视野中的菌液体积=××个/mL目镜中的视野�EMBEDMSPhotoEd.3���每个视野的面积由目测微尺的单元格量出，视野中菌液的体积按比例折算_1039499599.bin2.计数器(血球计数板）测定法计数格=4×4=16大格血球计数板盖玻片载玻片每小格深0.1cm�EMBEDMS_ClipArt_Gallery���1大格=5×5=25小格1小格=0.05cm×0.05cm=0.0025cm2总体积=16×0.1×25×0.0025=0.1cm3=0.1mL提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(90个÷125)*400/0.1ml=2880个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格），折算样品细菌浓度；3.比例计数法 比例——样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5×400万个/ml=2.2×107个/mL样品 红血球数已知(男性400~500万个／ml，女性350~450万个／ml)，平均400万个/ml样品溶液与等体积的血液混合涂片�EMBEDMSPhotoEd.3���_1039499599.bin4．比浊计数法 浊——细菌悬浮液的浊度 提问：如何定量二者关系呢？ 细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比考试6 1.X、γ射线的杀菌机理是什么？ 2.氧化剂的杀菌机理是什么？ 3.福尔马林的主要成分是什么？ 4.乙醇杀菌机理是什么？其最佳杀菌浓度是多少？ 5.青霉素的抗菌机理是什么？ 6.直接计数法的特点是什么？有哪些具体方法？4．比浊计数法 浊——细菌悬浮液的浊度 细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比（1）制曲线（OD~No） （2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量分光光度法测浊度1234其他细菌计数法细菌数量10100100010000个/mL细菌数量制标准曲线菌液浊度（二）间接计数法(活菌计数法) 提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？ 繁殖 提问：细菌繁殖的可见现象是什么？ 产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养） 计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌. 缺点：慢 分固体培养法和液体培养法无菌水 1.稀释平板计数法—固体培养法第一步：菌样巧妙稀释得到不同稀释度（10-x）菌液1mL混合1mL混合9mL10mL1：10-110-1：10-210-210-310-410-5各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。第三步：培养稀释度过低，菌落密集无法计数可以计数，但数量过多，费时费力数量合适，统计计算，作为结果数量太少，误差因素太大，不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落 一般计数平板的细菌生长菌落数以30~300个为宜。 细菌数量=？ 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25×107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 如国标法水中细菌总数的测定。 注意：作空白及取平行样（2～3组）均值减小误差平均2.稀释液体计数法 特点：液体培养、统计学查表计数 又称MPN法（或最可能数法） MostProbableNumber 例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量 提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？ 一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培养箱） 对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。（1）稀释（2）稀释接种样品在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，恒温37℃培养14天记录变黑的试管情况（3）培养1ml+9ml培养基 提问：为什么有些试管变黑有些没有？ 稀释程度、取样概率(4)统计－查表－计算 根据不同稀释度变黑试管 ①统计出数量指标 三位数及其中最低稀释度 （取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数） 提问：上例情况而言统计数量是几？ ②查表 表——MPN表32010-4MPN三管法测数统计表水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。个菌/毫升 细菌最可能数——通过其他精确的计数法，确定的各种数量指标时细菌数量的最可能值上面例子中数量指标“320”对应的细菌最可能数为9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为？个菌/毫升。 数量指标 细菌最可能数 数量指标 细菌最可能数 数量指标 细菌最可能数 数量指标 细菌最可能数 000 0.0 121 1.5 223 4.0 320 9.5 001 0.3 130 1.6 230 3.0 321 15.0 010 0.3 200 0.9 231 3.5 322 20.0 020 0.6 201 1.4 232 4.0 323 30.0 100 0.6 202 2.0 300 2.5 330 25.0 101 0.4 210 1.5 301 4.0 331 45.0 110 0.7 211 2.0 302 6.5 332 110.0 102 1.1 212 3.0 310 4.5 333 140.0 110 0.7 220 2.0 311 7.5 111 1.1 221 3.0 312 11.5 120 1.1 2223.5 313 16.0 3.薄膜计数法 薄膜——微孔滤膜（φ0.45um）（2）滤膜培养膜有菌面冲上 原理——膜抽滤（细菌浓缩）+膜平板培养+计数 （3）统计计数 提问：假如测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？ 250÷50ml=5个/ml自来水 样品中的细菌数量=菌落数÷抽滤样品的体积数 要求——样品洁净 如空气或饮用水。 ？ 堵孔、菌太多难以分散 提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？ 减少滤液体积、无菌水稀释(三)重量法 提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？ 已知单个细菌的平均重量除法计算 细菌的湿重量＝10-15~10-11g/个细胞 干重约为湿重的10％~20％。 1.干重法 方法：含菌水样在105～110℃下进行干燥恒重（本质测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS）。 悬浮物＝无机物+有机物（包括细菌） 提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？ 高温(550℃)灼烧 无机物化学性质稳定，高温下不会分解 提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？ 悬浮物中绝大多数是细菌。（1）悬浮物中绝大多数为细菌时 细胞数目=MLSS÷个体细菌的平均干重量恒重或MLSS悬浮物（2）除细菌外还有大量无机悬浮物时 W无 MLVSS挥发性悬浮物＝MLSS－W无=细菌群体的干重量 细胞数目=MLVSS÷个体细菌的平均干重量2hMLSS（3）有大量非细菌有机悬浮物时 提问：如何测定呢？ 不能用重量法，应改用其他方法。 总体来说重量法方法误差较大，一般只作为菌数粗略估算 如活性污泥测定（以重量MLSS、MLVSS间接表示细菌数量）2.细胞含N量法 大多数生物包括细菌，细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般为蛋白质干重15％~16％，平均为16％。 ＊还需要测定哪些条件可以由以上比例确定菌样中细菌浓度？如何试验操作及计算呢？3.DNA含量法 同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量 少量纯细菌培养时细菌数量的测定。 精确性非常高，对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，(四)其它生理生化指标法劳伦斯方程KX提问：v指什么？COD降解vO2消耗v＆＆产物产生v？求作试验！ 提问：当你需要测定某水样中细菌数量时，你该如何选择方法？视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取二、细菌的生长特性 “生、老、病、死” （根据投食方式）分间歇式培养（分批培养）、连续式培养两种情况 1.间歇培养 提问：如何人工进行细菌间歇培养？ 只有开始时的一次性投料和接种细菌（其余时间细菌根据环境变化自行生灭）（“坐吃山空型”）应用：生理特性研究、生物发酵和生物治污（1）活细菌重量变化曲线曲线：群体重量W(mg/l)——时间t细菌内源呼吸及细菌大量死亡阶段曲线t`点切线斜率值=?t`重量增长速率t`生长情况用活细菌生长曲线来描述①增长速率上升阶段 提问：为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？ A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大②增长速率下降阶段 提问：为什么增长速率较前下降了？增长率下降阶段mg/mL0时间t活细胞重量 营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降 这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止 代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制③内源呼吸及死亡阶段 ———内源呼吸+毒物浓度更高 （个体）瘦→死 （群体）死亡率大于出生率 从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。 提问：此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？ 不是，利用死亡细菌的残体营养 各种生物具有类似的规律 实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线，虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途。考试7 1.间接计数法包括哪三种方法？ 2.平板上菌落数为多少时适合计数？ 3.滤膜的孔径是多少？MPN的含义是什么？ 4.重量法包括哪些方法？ 5.生理生化指标法的依据是什么？包括哪些指标？ 6.间歇培养活细菌重量生长曲线包括那几个阶段？作业问 细菌C:H:O:N质量百分数比例为50.89%:6.2%:30.52%:12.3% 分子式——摩尔百分数比例50.89％6.2%30.52%12.3%1211614：：： C5H7NO2或C24H35N5O11Sheet1 C H N O 质量百分数 50.89% 6.20% 12.30% 30.52% 摩尔质量 12 1 14 16 摩尔比例(=质量百分数/摩尔质量) 0.0424083333 0.062 0.0087857143 0.019075 113.8211382114 CHON? 4.8269647696 7.0569105691 1 2.1711382114 CHON? 24.1348238482 35.2845528455 5 10.8556910569Sheet2 Sheet3 2．细菌数量生长曲线稳定期衰老期细菌的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便，0~10代表1～1010总菌数活菌数（1）缓慢期－“万事开头难” 特征：细菌缓数慢目期的对数值0时间t提问：为什么会出现迟缓期呢？ 代谢活跃，个体体积、重量增高 不立即进行细胞分裂、增殖，数量不变甚至减少适应环境（合成相应的酶），营养储备（用于复制合成） 提问：根据上述原因选择接种何种状态的细菌迟缓期会较长？ 对数期的细菌、稳定期或衰亡期、受损细胞、富集培养基的细菌 后三种稳定期细胞基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分受损细胞养伤修复富集培养基细菌需要合成“自力更生”酶菌种本身的遗传特性（如转基因高效菌）和接种数量也会影响迟缓期的长短。在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的迟缓期，迟缓期的出现会增加操作时间，降低工作效率 采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除迟缓期提问：我们可以通过哪些手段缩短迟缓期呢？（2）对数期（青年） 所有细菌均繁殖故称对数期。（相当于重量法细菌曲线的增长率上升阶段） 细菌数目X增长率倍率的对数与时间成正比。K——比例常数�EMBEDEquation.3����EMBEDEquation.3���_1039586786.unknown_1042709260.unknown_1039586587.unknown特点 平均代时（繁殖一代的时间）最短 提问：细菌的代时与哪些因素有关？细菌数目的对对数数期值0时间t如大肠杆菌在20℃时其代时是35℃条件下的2倍；伤寒杆菌在含0.125％的蛋白胨培养基中的代时为800min，而在含1.0％时仅为40min。四个时期 繁殖速度最快 种类遗传、个体健康情况(营养、环境条件) 提问：哪个时期（迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期）代时最具有种属代表性？为什么？ 最短值→无限长（休眠） 对数期代时——最短值 细菌代时通常指最适条件下的对数期代时对数期细菌代时G计算 此时所有细菌在二分裂生长,分别测定t0时刻与t时间细菌的数量X0与X 1→2→22→23((22)×2)→24→25……2nX=X0*2nX/X0=2n X0→……X0·24→……X(X0·2n)(n=1、2、3…) n—繁殖代数 代时�EMBEDEquation.3���_1039585554.unknown_1039585788.unknown（3）稳定期（中年） 出生率＝死亡率细菌缓数慢目期的对稳定期对数衰老期数期值0t时间 死亡原因— 营养短缺、代谢毒物增多 （相当于重量变化曲线中的增长率下降阶段）（3）死亡期（老年） 死亡率＞出生率（相当于重量法的内源呼吸阶段） 提问：如何给细菌延年益寿呢？ 补营养、环保（去除环境毒物）人类群体有类似规律吗？ 如果把地球看作是封闭的间歇式培养基，人类看作是细菌，人口若不加控制，必将经历由于资源枯竭，污染物遍地而引发的大灭绝。 自救——节约、节育防止“营养物消耗过快”，环保防止“有害代谢物毒性抑制”。3.连续培养 一方面连续进料，另一方面又连续出料。 原理：进料=补足营养(“污染物”) 出料=稀释菌浓度、毒物浓度 它又分为两种：恒浊连续培养、恒化连续培养。（1）恒浊连续培养 恒浊——培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）新鲜培养基光电池光源流速控制阀出水 很少应用反馈控制（2）恒化连续培养 化——？新鲜培养基流速控制阀出水 应用：环境工程、生物工程、实验室研究（细菌生理特性研究、细菌的快速筛选等）。流速恒定进料营养物总量 目前,污水连续生物处理法均类似于恒化连续培养；（流速不完全恒定）4．污(废)水连续处理中的细菌生长状态 不同的生物反应器，细菌的生长状态可能不同！ 乃至同一反应器内不同位置处连续生物处理中的细菌状态表细菌的生长阶段应用举例特点迟缓期无连续化稳定操作中没有这一阶段对数生长期高负荷活性污泥法(大部分区域)稳定期生物膜法常规活性污泥法(大部分区域)衰老期污泥的厌氧消化1:0.4~0.8BOD.d-细菌与降解BOD重量比1:0.4以下对数期稳定期衰老期 平推流式活性污泥法 细菌生长必然维持在一个与水质环境相适应的阶段； 提问：同一种方式中的细菌生长状态是否一成不变呢？ 随水质波动而波动 毒害物波动(“冲击”) 营养波动(“失衡”) 提问：改善废水生物处理系统中效果的关键是什么？ 防止“冲击”、找出并改善限制因子 “失衡”是绝对的！ 总有限制性营养物控制生长。 (———按营养配比，相对贫乏的营养物)（1）稀释率(1/停留时间)稀释速率DF——进出料流速；停留时间RT(residencetime)＝？——相对进料（稀释）速率D正比于F，即单位时间内提供给细菌的营养物质数量尤其是限制性因子的数量。如5.连续培养中的“洗脱”（2）稀释率的影响 稀释（即进料）同时引起反应器内细菌数量的↑↓细菌随排出液排出，细菌量减少细菌繁殖增加 ？ 营养物充足细菌增量↑ 流失菌量FC（菌体浓度）使反应器中的细菌数量↓FF提问：为什么A前D↑代时↓呢？营养充分利用 （3）洗脱现象营养限制减弱A稀释速率A点是对数期代时对应最小稀释率。细菌代时缩短引起的细菌增量=细菌输出减量； A后细菌洗脱区代时短至极限，增量＜排出减量结果——平衡打破，“洗脱”？ 应用：废水生物处理中可从混合微生菌中进行高效菌的快速筛选 提问：为什么可以呢？ 混合菌对于同一营养物能否利用，以及利用速率是不同的，代时不同。F↑，D不断↑洗脱 比较而言，代时最短的细菌（高效菌），最后被洗出。 思考题＊ 为筛选能降解丙烯腈（或硝基苯等等）的细菌，如何利用洗脱法快速筛选对丙烯腈高效降解的生物？如果该菌的代时仍然相对工厂所要求的稀释率短该如何解决呢？第二节细菌的遗传与变异 遗传性— “种瓜得瓜种豆得豆”正面：继承亲代优点，保持物种延续 1.遗传的保守性 ——子代与亲代相似性（“大同”）负面：？“劣汰”“优胜”2.变异的多样性 细菌变异形式， 如：个体形态的变化，菌落形态(光滑型／粗糙型)的变异，营养要求的变异，对温度、pH要求的变异，毒性的变异，抗毒能力的变异，生理生化特性的变异及代谢途径、产物的变异等。 “龙生九子，各不相同”3.遗传与变异的分子机制 根源？ DNA复制传递的稳定性遗传的保守性复制传递的差错性变异的多样性DNA4.细菌的选育*（重点）与细菌的变异 选育—筛选与定向培育 筛选—“众里挑一” 定向培育—“教育培训” 定向培育在水的生物处理俗称驯化。(1)细菌的筛选方法 原理：优胜劣汰 方式：选择性培养基（天然+人工） 天然——特殊区域采样 例如筛选能降解石油的细菌？ 收集长期被石油污染的土壤(天然选择性固体培养基），必有适应石油环境利用石油作为食物的细菌，将土壤样品在实验室用石油降解菌选择性培养基，对样品中的石油降解菌进行进一步的选择培养，筛选分离，富集，为下一步的驯化工作奠定基础。　驯化选择性培养基（石油）浓度升高筛选分离23、414小考中考高考实验通知 A.分组———每班以三人为单位分成小组，其中两男一女；并从一班到三班依次每7小组为一大组，分为五大组（下周一交名单） B.时间———4.24（周六）、4.25（周日）、4.28日下午每半天一大组作试验 上午7:30下午2:00开始 C.内容———1.显微镜介绍及基本操作；2.细菌及其它微生物的特殊结构观察3.微生物染色技术4.环境中微生物 D.要求———写试验预习报告，试验前检查（没有不得试验），并提问（回答情况同样作为成绩记录）； 1.细菌数量生长曲线包括哪几个阶段？ 2.细菌的代时G为哪个时期的？如何测算？ 3.各种废水生物处理法中微生物所处生长状态由什么决定？ 4.细菌连续培养有哪些培养方式？如何测稀释率(D)? 5.为什么恒化培养D提高产生不同生物逐次“洗脱”现象? 6.什么是细菌的选育？如何进行特殊细菌筛选？考试8（2）细菌的驯化 ①渐变－诱导法(休眠的酶基因复活+自然突变) 方法：待降解物通常为有机毒物或惰性物。5选择性培养基（待降解物，如石油）浓度升高5n大一→大四死 筛选与诱导驯化可以同时进行 特点:操作简便，驯化的潜力有限，慢。结果②突变—诱变法 提问：哪些因素可以引起基因突变呢？ 诱变剂：温度、紫外线、核辐射、酸、碱、化学诱变剂等等。 提问：基因突变的分子机制？ DNA碱基丢失、增多、错配等 点突变→染色体畸变 基因突变有这样几个特点。A．基因突变的特点 发生Ⅰ.随机性结果Ⅱ.无定向性 基因突变在哪一个细菌中发生是随机的，突变基因的部位也是随机的。突变的发生没有固定的方向。 频率Ⅲ.稀有性可Ⅳ.诱变性 突变率（每一细菌在每一世代中发生某一性状突变的机率）通常为10-5~10-10。十万至一百亿个细菌中才可能有一个细菌的基因发生突变。 人工诱变可提高10～105倍 Ⅵ.可逆性 修复成功 Ⅴ.稳定性 修复失败 产生的变异性状是稳定的、可遗传的。 利用基因突变的特点，可以通过人工诱变进行细菌的基因改造。 常用的诱变剂：紫外线、5—溴尿嘧啶、亚硝酸、卟啶染料等。 诱变的步骤 Ⅰ.制出发菌株的单细菌悬浮液 提问：为什么？如何在整个过程中尽量使细菌分散呢？ 诱变剂与细菌充分接触；向细菌培养液中加入玻璃珠，并保持在诱变过程中始终进行振荡搅拌形成出发细菌的单细菌悬浮液；B．方法 Ⅱ.选择合适的诱变剂剂量进行诱变 提问：为什么要有剂量限制呢？ 少,效率低;过高“是药三分毒”会造成细菌大量死亡。 例如在进行细菌紫外诱变时，通常使用15或20W的紫外灯距离细菌单细菌悬浮液15~30cm，照射15~20min。 Ⅲ.筛选突变出的高效菌 提问：如何筛？ 选择性培养基评价 诱变法潜力要远大于诱导法，但操作复杂。在实际诱变中，往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体。最后这些突变体将会在实验室小试、中试的基础上被投放到生产实践中。 参见《环境微生物学技术手册》（图馆X172-6201） 通常生产上更多利用的是诱导法。 污泥培养初期逐步提高污水比例，有些菌种不能适应被淘汰(筛选)，能产生诱导酶的菌株及自发突变体中能来降解此类废水的菌种能够生存而被保留下来，且能力逐步提高，使废水达到预期的排放标准； *诱变菌株环保市场的开发前景如何?目前国内外有哪些主要的此类公司?③基因重组法 不同个体基因重新组合 A．形式 自发基因重组与人工基因重组 自发基因重组 a.真核生物为杂交； 精卵细胞质融合过程中所有遗传物质的重组 b.原核生物为转化、转导、接合； 部分遗传物质的转移和重组提问：要获取国外的某些先进技术（部分基因）有哪些途径？ 细菌亦然Ⅰ.转化Transformation（引进） 供体细菌研碎物中的DNA片段直接吸收进入活的受体细菌并发生基因重新组合的方式。 受体细菌获得了供体细菌的部分遗传性状—“转运同化” 转化现象是1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现的,，被命名为格里菲斯实验（证明DNA是生命遗传物质的经典实验之一）。无毒杀死杀死转化现象格里菲斯实验？？ 1944年才通过试验找出了其中的原因。试验方法如下：目前发现自然状态下许多其它细菌、放线菌、真菌和高等动植物中都也有转化现象。SⅢ型细菌光滑有毒的细胞破裂细胞DNA抽提物混合粗糙无毒的RⅡ细菌SⅢDNA抽提物被有些RⅡ细菌混合DNA酶降解的DNA残骸吸收SⅢDNA+未变化的RⅡ细菌少数转化成S细菌RⅡ细菌（1/106） Ⅱ.接合（合作） Ⅲ.转导（间谍窃取） 间谍？ 噬菌体－细菌病毒 通过噬菌体的携带而转移导手的基因重组现象称为转导。 转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。 细菌有性生殖LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是能合成色氨酸（B+）但不能合成组氨酸（A-）的沙门氏伤寒杆菌超微烧结玻璃板细菌不能通过，噬菌体可以通过转导能合成色氨酸间谍侵入、重组“转移、导手”B.人工基因重组—遗传工程 遗传工程是70年代初发展起来的生物技术。 定义：对遗传物质进行改造（人工干预下的杂交、转化、接合、转导）的技术。 工程：类似工程那样有很高的预见性、精确性与严密性。 a.遗传工程的方法 遗传工程方法包括两个水平的研究：一种是细胞水平；另一种是基因水平。所以，又可把它分为细胞工程和基因工程。 细胞工程——两个细胞原生质体融合 基因工程——两个细胞DNA片段剪接拼接 狭义的讲，遗传工程就是基因工程。 原理：限制性核酸内切酶在特殊培养基上（如含有青霉素）筛选目的细菌长出必然是重组成功的细菌外源基因片段详见《生物化学》有关章节b.遗传工程在环境工程中的应用 Ⅰ.降解石油的工程细菌 70年代美国生物学家查克捡巴蒂(Chakrabarty)针对海洋输油，造成浮油污染，影响海洋生态等问题进行了研究。石油成分复杂，是由饱和、不饱和、直链、支链、芳香……烃类组成，不溶于水。而海水含盐量高，虽发现90多种微生物有不同程度降解烃类的能力，但不一定能在海水中大量繁殖生存，而且降解速率也较馒，查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中2／3的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。见下图。接合接合接合�EMBEDMSPhotoEd.3���_1039730250.bin Ⅱ.耐汞工程菌 日本水俣事件及瑞典鸟类汞中毒事件后，日本和瑞典对汞在自然界转化做了大量研究工作，提出了汞化合物转化的途径，主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞，使人及生物中毒。另一面自然界中存在一些耐汞的微生物，它们的耐汞基因在质粒R因子上。 例如，恶臭假单胞菌一般在超过2ug／ml汞浓度中即将中毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得MER质粒，可在50~70ug／ml氯化汞中生长。 Ⅲ．脱色工程菌的构建 将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号Kx和Kd两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程菌。 基因工程方法看似简单，但在具体实施上有较大的难度。A.细菌的质粒本身容易丢失或转移B.质粒具有不相容性 （只有在一定条件下，属于不同的不相容种群的质粒才能稳定地共存于同一宿主中。） *使用哪些方法有利于不同质粒的相容?国内那些科研院校进行基因重组工程菌的开发研究? 细菌形态 细菌生理 细菌遗传与变异第四章其它微生物