在,飞蝗与草原蝗虫的频繁发生还会延续到21
世纪。为此建议:近年除应特别重视我国东部季
风区黄河的兴衰、扩展、萎缩、断流等演化动态
与飞蝗蝗区的兴衰、演化的相关规律性研究外;
还应对干旱、半干旱区的广大草原有害蝗种与
青藏高原河谷地带的西藏飞蝗的猖撅发生动态
加强监测。
我们必须坚持农业牧业走可持续性发展的
道路,继续贯彻“改治并举,根除蝗害”的治蝗方
针,并针对中国蝗灾发生的多样性、严重性、复
杂性和持久性等特点,运用系统生态学和生态
工程学的观点、
,采取“植物保护、生物保
护、资源保护、环境保护”相结合的生态学治理
对策,加强蝗虫灾害学的系统理论研究和应急
生物、物理、化学新技术的研究与开拓。可望在
全球变化影响下使我国蝗虫灾害得以生态学治
理和可持续控制。
4 参考文献
1 陈永林.改治结合,根除蝗害.见:中国科学院动物研究
所主编 中国主要害虫综合防治.北京:科学出版社,
1979,252-280.
2 陈永林.中国蝗虫灾害.见:孙广忠等著.中国自然灾害
北京:学术
刊出版社,1990,235-252.
3 陈永林.我国是怎样控制蝗害的.中国科技史料,1982,
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4 陈永林.亚非地区蝗虫发生动态分析.世界农业,1987
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5 Chen Yong-lin. The Locust and Grasshopper Pests of
China. Beijing: China Forestry Publishing House, 1999,
1- 80.
基因芯片分析技术(一)
常智杰 张淑平 (清华大学生物科学与技术系北京100084)
摘要 墓因芯片技米是近年发展起来的一项新技术。文中较详细地阐述了基因芯片
的概念、种类、操作过程和应用。
关键词 基因芯片 操作 应用
基因芯片(gene chips)技术是近年来发展
起来的一项新技术,这项技术的关键点是将巨
大的DNA分析缩小到很小的芯片上,利用光
电技术对信号进行探测,最后用计算机加以分
析。这项技术之所以受到广泛的关注,就是因为
它将过去生物学中的复杂实验变得十分简单,
同时检测的数据大大增多,可以说是生物技术
上的一次革命。由于该技术涉及面较广,加之作
者水平有限,故本文仅就最基本的基因芯片技
术作一简单介绍。
1 基因芯片的概念
基因芯片,亦指DNA微阵列,是将大量
DNA片段有规则地固定在某种介质上,从而检
测特定基因表达的一项技术。这项技术的基本
原理是分子生物学中常用杂交方法的扩展,其
基本做法是将要检测的样品加以标记,然后与
2000年第35卷第7期 生 物 学
做成的阵块进行充分杂交,再加以洗脱后,用图
像显示出结果。这里,在阵块中排列的DNA片
段应是已知的序列。根据这种概念,我们可以看
出,在这项技术中,有如下三点是非常关键的。
其一是要有大量的已知序列基因或基因片段。
随着人类基因组
的实施,我们可以得到大
量基因序列信息,可以将一个文库的所有。D-
NA序列测到并加以记录,从而可以将一个文
库排列成一个DNA阵列。因此,从理论上讲,
可以做成从微生物到人类各组织器官的文库阵
列。其二,从工艺的角度讲,要求能够将不同的
DNA片段以很高的密度“点印”在普通载玻片
大小的介质上,从而使得在很小的面积上可以
排列成千上万个基因而不致于相互混杂,这个
过程要求相当高水平的工艺技术。其三,要有一
种很好的检测手段。目前看来,用不同的荧光标
通 报 一 5一
记核酸来进行检测是一种比较简单,而且安全 用作阵列的DNA可以是双链的,亦可以
可靠的方法。同时,不同的荧光可以使得我们同 是单链的。但是其长度最好是小于开放阅读框
时检测几种样品。这样,对于差异显示这类实验 架,或小于1 000bp的cDNA。这对于很多具有
来说,就显得尤为简便。 同源性的基因尤为重要。当基因之间具有很高
基因芯片一般可分为两种,一种为“点印” 同源性时,最好选择基因之间有差异的部分,这
阵列;一种为直接合成阵列。“点印”阵列是将较 样便可以提高基因之间的分辨度。所以,在考虑
大的片段(大于l00bp)物理地固定在介质上, 每个基因代表性的同时,应充分考虑所研究问
而直接合成阵列则是直接在介质上合成较短的 题的具体情况。
片段。一般而言,DNA样本都是收集在96孔或 2. 1. 2 PCR扩增 一般而言,100川PCR反
384孔板上,这些样本可以是PCR产物,也可 应体系得到的产物足以点印 1 000个基因芯
以是从质粒上直接得到的片段等。然后,用机械 片。PCR通常是在96孔PCR仪上进行扩增。
手将DNA通过特制的加样头进行点样。点样 实际扩增的反应条件要根据所用的
及引物
完成后,对介质进行处理以使DNA能够十分 来确定。但要尽量减少PCR反应体系中的组
稳定地附着在介质上,同时还要使介质尽量减 分,尽量只用模板、引物、核普酸、Mg ++、
缓
少结合非特异性的探针。 冲液和酶。不要用甘油或明胶,它们往往会粘附
2 基因芯片的操作过程 在阵列块上而影响以后的点样工作。
基因芯片制作从准备探针(即扩增DNA 2.1.3 点样前DNA准备 点样以前,要将
片段)开始,经过芯片加工、DNA阵列点印、芯 PCR产物清洗纯化干净,并且对DNA进行一
片后处理及芯片质量检测等过程,其应用包括 些处理,一般用异丙醇沉淀PCR产物,以除去
RNA制备、标记、杂交及成像分析。因此,基因 酶、离子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇洗1
芯片的应用包括了制作工艺过程和基因表达分 次,再用95%乙醇洗1次,待完全干燥后,将所
析过程。 沉淀DNA重溶在3 X SSC中,其浓度掌握在
2.1准备DNA 作为基因分析,DNA片段是 100ng/川左右。由于处理的样本量很大,一般
最基本的材料,也是基因芯片制作的关键。对于 直接在 96孔板上直接操作,可选用能够配置
不同的阵列,可以选择不同的目的DNA. 96孔板的离心机(如Savant Speed Vac Plus
2.1.1 目的DNA的选择 对于大规模地研 SC210A)。当把DNA溶于10-15p1 3 X SSC
究基因表达问题,需要分析每一个基因的表达。 (pH7. 0)中后,最好置于4'C至少12h。然后,将
因此,选择的目的DNA必须能够代表要研究 DNA溶液封存在一20`C-4`C o
的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的 ; 当然,纯化DNA的方法多种多样,使用者
生物,最直接的方法是用PCR扩增基因组中每 可以根据自己的情况选用。在此应当强调的是,
个已知的或预测的开放阅读框架(open reading 在最后得到的DNA样本中,应尽量减少其它
frame),亦可以选择自己感兴趣的部分序列。 污染,尽量除去盐类、去污剂、甘油、明胶以及树
对于没有测序,或只有部分测序的基因组, 脂颗粒等。具体实践中,应当用小规模DNA样
或者对于那些有大量内含子的基因组,上述方 品进行点样测试,待确定效果后,再大规模制
法就不现实。在这种情况下,我们首先考虑采用 作。
表达序列标记(EST)。可以将单个EST的cD- 2.2 准备载物片 载物片是要将DNA点上
NA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因 去的支撑物,有不同的材料,通常用载玻片。
组测序计划或序列还未知的生物,可以利用 DNA并不能直接固定在玻璃表面,因此需要对
cDNA文库作为DNA来源。当然这种文库最 玻璃表面进行处理。有很多方法可以处理玻璃
好是经归整化处理过,以减少不必要的冗余。 表面,但是我们认为用多聚一L一赖氨酸比较简单
- 6一 生 物 学 通 报 2000年第35卷第7期
可靠。
首先充分清洗载玻片。用25 0,NaOH溶液
200m1加300m1 95%乙醇配成500m1碱性清洗
液,将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h,再用清
水冲洗5遍并将载玻片泡在水中。接下来就是
用多聚一L一赖氨酸溶液浸泡,从而使多聚赖氨酸
均匀涂包在玻璃表面,形成一种多聚一L一赖氨酸
涂面。具体做法是配成350m1多聚一L一赖氨酸浸
泡液,将洗净的载玻片直接浸泡,浸泡期间保持
慢速摇晃,1h后取出并在水中浸泡清洗,最后
干燥。一般将涂好的载玻片用锡铂纸包好,室温
放置1个月,进行熟化,以使表面保持充分的疏
水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。
2.3 基因芯片的点印 点印DNA用机械手。
将一组处理好的载玻片固定在一个平台上,将
DNA样品(溶在3 X SSC中)装在96孔或384
孔的平板中,并将平板放在支架上。机械手将一
组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔
中,让每个吸头充上约1风的DNA溶液,然后,
机械手轻轻地将吸头移向载.玻片,将DNA样
品完全一致地点到多聚一L一赖氨酸包被的载玻
片面上。每个载玻片上大约点<0.5川的DNA
溶液,故理论上一次可以点印2 000个载玻片。
待这一组DNA样品点印完成,机械手清洗点
样吸头,开始第二批样品的点印。点样的质量主
要表现在点与点的距离,这取决于点样吸头的
尖锐度与多聚一L一赖氨酸涂面的疏水性。一般情
况下两个点中央间距为 200t.m,点间空
l00llm。如果点间空为200Km,就可以把整个酵
母基因组点印在1. 8cm“大的面积上;如果点间
空为l00um,可以把人类75 000个基因全部点
在一张2. 54cm X 7. 62cm的普通载玻片上。目
前,每个点样循环持续大约为2min,包括清洗、
干燥、加样和点样,一般点110张片子。如果增
加点样吸头数,可以缩短点样时间。如将点样吸
头增加到32个,则完成110个载玻片的所有人
类基因点样工作约需2天时间。
2.4 基因芯片的后加工处理 当一个基因芯
片点成之后,需要对其进行进一步的加工处理,
以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步
处理,即重新水合化及快速干燥、UV一交联、封
闭及变性。
2.4.1 重新水合化 通常点样过程并不能保
证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点
中都分布均匀,需要对之进行重新水合化并进
行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当
重新水合化不充分时,大小不规则的点会影响
以后的杂交与分析效果。但当过度水合化时.,点
与点之间可能会产生融合。因此。要确定一个
十分准确的水合条件。一般用蒸汽熏润,其时
间、温度需要摸索。
2.4.2 U V交联 当重新水合化并立即干燥
后,将载玻片放在UV射线下照射,这样可以
使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA
浓度低时尤为重要,可以增加可杂交DNA吸
附到每一个点上的量。在UV交联时,将载玻
片有DNA点的面朝上,照射总能量强度为
60mJ即可。
2.4.3 封闭 封闭的主要目的是将游离赖氨
酸基团加以修饰,以避免这些基团与以后被标
记的DNA结合。如果不对载玻片封闭,那么,
将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交
斑,而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法
是用琉拍酸醉进行酸基化,将赖氨酸的氨基转
化成酞氨基,使之形成负电荷表面,从而减小与
DNA的非特异结合。这一过程一般在15min
内结束。
2.4.4 变性处理 当封闭过程完成后,要立即
进行变性处理,即将整个载玻片立即浸入沸开
但不冒泡的水中,上下翻3^-5次,停留2min,
然后立即转到95%的乙醇中,浸泡一会儿后离
心干燥,这样便完成了对芯片上DNA的变性
处理。此时,整个基因芯片块也就做好了。
(待续)
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