基因芯片分析技术

在，飞蝗与草原蝗虫的频繁发生还会延续到21 世纪。为此建议:近年除应特别重视我国东部季 风区黄河的兴衰、扩展、萎缩、断流等演化动态 与飞蝗蝗区的兴衰、演化的相关规律性研究外; 还应对干旱、半干旱区的广大草原有害蝗种与 青藏高原河谷地带的西藏飞蝗的猖撅发生动态 加强监测。 我们必须坚持农业牧业走可持续性发展的 道路，继续贯彻“改治并举，根除蝗害”的治蝗方 针，并针对中国蝗灾发生的多样性、严重性、复 杂性和持久性等特点，运用系统生态学和生态 工程学的观点、，采取“植物保护、生物保 护、资源保护、环境保护”相结合的生态学治理 对策，加强蝗虫灾害学的系统理论研究和应急 生物、物理、化学新技术的研究与开拓。可望在 全球变化影响下使我国蝗虫灾害得以生态学治 理和可持续控制。 4 参考文献 1 陈永林.改治结合，根除蝗害.见:中国科学院动物研究 所主编 中国主要害虫综合防治.北京:科学出版社， 1979,252-280. 2 陈永林.中国蝗虫灾害.见:孙广忠等著.中国自然灾害 北京:学术刊出版社，1990,235-252. 3 陈永林.我国是怎样控制蝗害的.中国科技史料，1982, 15- 22. 4 陈永林.亚非地区蝗虫发生动态分析.世界农业，1987 (1) :28-31. 5 Chen Yong-lin. The Locust and Grasshopper Pests of China. Beijing: China Forestry Publishing House, 1999, 1- 80. 基因芯片分析技术(一) 常智杰 张淑平 (清华大学生物科学与技术系北京100084) 摘要 墓因芯片技米是近年发展起来的一项新技术。文中较详细地阐述了基因芯片 的概念、种类、操作过程和应用。 关键词 基因芯片 操作 应用 基因芯片(gene chips)技术是近年来发展 起来的一项新技术，这项技术的关键点是将巨 大的DNA分析缩小到很小的芯片上，利用光 电技术对信号进行探测，最后用计算机加以分 析。这项技术之所以受到广泛的关注，就是因为 它将过去生物学中的复杂实验变得十分简单， 同时检测的数据大大增多，可以说是生物技术 上的一次革命。由于该技术涉及面较广，加之作 者水平有限，故本文仅就最基本的基因芯片技 术作一简单介绍。 1 基因芯片的概念 基因芯片，亦指DNA微阵列，是将大量 DNA片段有规则地固定在某种介质上，从而检 测特定基因表达的一项技术。这项技术的基本 原理是分子生物学中常用杂交方法的扩展，其 基本做法是将要检测的样品加以标记，然后与 2000年第35卷第7期 生 物 学 做成的阵块进行充分杂交，再加以洗脱后，用图 像显示出结果。这里，在阵块中排列的DNA片 段应是已知的序列。根据这种概念，我们可以看 出，在这项技术中，有如下三点是非常关键的。 其一是要有大量的已知序列基因或基因片段。 随着人类基因组的实施，我们可以得到大 量基因序列信息，可以将一个文库的所有。D- NA序列测到并加以记录，从而可以将一个文 库排列成一个DNA阵列。因此，从理论上讲， 可以做成从微生物到人类各组织器官的文库阵 列。其二，从工艺的角度讲，要求能够将不同的 DNA片段以很高的密度“点印”在普通载玻片 大小的介质上，从而使得在很小的面积上可以 排列成千上万个基因而不致于相互混杂，这个 过程要求相当高水平的工艺技术。其三，要有一 种很好的检测手段。目前看来，用不同的荧光标 通 报 一 5一 记核酸来进行检测是一种比较简单，而且安全 用作阵列的DNA可以是双链的，亦可以 可靠的方法。同时，不同的荧光可以使得我们同 是单链的。但是其长度最好是小于开放阅读框 时检测几种样品。这样，对于差异显示这类实验 架，或小于1 000bp的cDNA。这对于很多具有 来说，就显得尤为简便。 同源性的基因尤为重要。当基因之间具有很高 基因芯片一般可分为两种，一种为“点印” 同源性时，最好选择基因之间有差异的部分，这 阵列;一种为直接合成阵列。“点印”阵列是将较 样便可以提高基因之间的分辨度。所以，在考虑 大的片段(大于l00bp)物理地固定在介质上， 每个基因代表性的同时，应充分考虑所研究问 而直接合成阵列则是直接在介质上合成较短的 题的具体情况。 片段。一般而言，DNA样本都是收集在96孔或 2. 1. 2 PCR扩增 一般而言，100川PCR反 384孔板上，这些样本可以是PCR产物，也可 应体系得到的产物足以点印 1 000个基因芯 以是从质粒上直接得到的片段等。然后，用机械 片。PCR通常是在96孔PCR仪上进行扩增。 手将DNA通过特制的加样头进行点样。点样 实际扩增的反应条件要根据所用的及引物 完成后，对介质进行处理以使DNA能够十分 来确定。但要尽量减少PCR反应体系中的组 稳定地附着在介质上，同时还要使介质尽量减 分，尽量只用模板、引物、核普酸、Mg ++、缓 少结合非特异性的探针。 冲液和酶。不要用甘油或明胶，它们往往会粘附 2 基因芯片的操作过程 在阵列块上而影响以后的点样工作。 基因芯片制作从准备探针(即扩增DNA 2.1.3 点样前DNA准备 点样以前，要将 片段)开始，经过芯片加工、DNA阵列点印、芯 PCR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一 片后处理及芯片质量检测等过程，其应用包括 些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去 RNA制备、标记、杂交及成像分析。因此，基因 酶、离子及核昔酸等。沉淀后用70%乙醇洗1 芯片的应用包括了制作工艺过程和基因表达分 次，再用95%乙醇洗1次，待完全干燥后，将所 析过程。 沉淀DNA重溶在3 X SSC中，其浓度掌握在 2.1准备DNA 作为基因分析，DNA片段是 100ng/川左右。由于处理的样本量很大，一般 最基本的材料，也是基因芯片制作的关键。对于 直接在 96孔板上直接操作，可选用能够配置 不同的阵列，可以选择不同的目的DNA. 96孔板的离心机(如Savant Speed Vac Plus 2.1.1 目的DNA的选择 对于大规模地研 SC210A)。当把DNA溶于10-15p1 3 X SSC 究基因表达问题，需要分析每一个基因的表达。 (pH7. 0)中后，最好置于4'C至少12h。然后，将 因此，选择的目的DNA必须能够代表要研究 DNA溶液封存在一20`C-4`C o 的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的 ; 当然，纯化DNA的方法多种多样，使用者 生物，最直接的方法是用PCR扩增基因组中每 可以根据自己的情况选用。在此应当强调的是， 个已知的或预测的开放阅读框架(open reading 在最后得到的DNA样本中，应尽量减少其它 frame)，亦可以选择自己感兴趣的部分序列。 污染，尽量除去盐类、去污剂、甘油、明胶以及树 对于没有测序，或只有部分测序的基因组， 脂颗粒等。具体实践中，应当用小规模DNA样 或者对于那些有大量内含子的基因组，上述方 品进行点样测试，待确定效果后，再大规模制 法就不现实。在这种情况下，我们首先考虑采用 作。 表达序列标记(EST)。可以将单个EST的cD- 2.2 准备载物片 载物片是要将DNA点上 NA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因 去的支撑物，有不同的材料，通常用载玻片。 组测序计划或序列还未知的生物，可以利用 DNA并不能直接固定在玻璃表面，因此需要对 cDNA文库作为DNA来源。当然这种文库最 玻璃表面进行处理。有很多方法可以处理玻璃 好是经归整化处理过，以减少不必要的冗余。 表面，但是我们认为用多聚一L一赖氨酸比较简单 - 6一 生 物 学 通 报 2000年第35卷第7期 可靠。 首先充分清洗载玻片。用25 0,NaOH溶液 200m1加300m1 95%乙醇配成500m1碱性清洗 液，将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h，再用清 水冲洗5遍并将载玻片泡在水中。接下来就是 用多聚一L一赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸 均匀涂包在玻璃表面，形成一种多聚一L一赖氨酸 涂面。具体做法是配成350m1多聚一L一赖氨酸浸 泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持 慢速摇晃，1h后取出并在水中浸泡清洗，最后 干燥。一般将涂好的载玻片用锡铂纸包好，室温 放置1个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏 水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。 2.3 基因芯片的点印 点印DNA用机械手。 将一组处理好的载玻片固定在一个平台上，将 DNA样品(溶在3 X SSC中)装在96孔或384 孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手将一 组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔 中，让每个吸头充上约1风的DNA溶液，然后， 机械手轻轻地将吸头移向载.玻片，将DNA样 品完全一致地点到多聚一L一赖氨酸包被的载玻 片面上。每个载玻片上大约点<0.5川的DNA 溶液，故理论上一次可以点印2 000个载玻片。 待这一组DNA样品点印完成，机械手清洗点 样吸头，开始第二批样品的点印。点样的质量主 要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的 尖锐度与多聚一L一赖氨酸涂面的疏水性。一般情 况下两个点中央间距为 200t.m，点间空 l00llm。如果点间空为200Km，就可以把整个酵 母基因组点印在1. 8cm“大的面积上;如果点间 空为l00um，可以把人类75 000个基因全部点 在一张2. 54cm X 7. 62cm的普通载玻片上。目 前，每个点样循环持续大约为2min，包括清洗、 干燥、加样和点样，一般点110张片子。如果增 加点样吸头数，可以缩短点样时间。如将点样吸 头增加到32个，则完成110个载玻片的所有人 类基因点样工作约需2天时间。 2.4 基因芯片的后加工处理 当一个基因芯 片点成之后，需要对其进行进一步的加工处理， 以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步 处理，即重新水合化及快速干燥、UV一交联、封 闭及变性。 2.4.1 重新水合化 通常点样过程并不能保 证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点 中都分布均匀，需要对之进行重新水合化并进 行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当 重新水合化不充分时，大小不规则的点会影响 以后的杂交与分析效果。但当过度水合化时.，点 与点之间可能会产生融合。因此。要确定一个 十分准确的水合条件。一般用蒸汽熏润，其时 间、温度需要摸索。 2.4.2 U V交联 当重新水合化并立即干燥 后，将载玻片放在UV射线下照射，这样可以 使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA 浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸 附到每一个点上的量。在UV交联时，将载玻 片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为 60mJ即可。 2.4.3 封闭 封闭的主要目的是将游离赖氨 酸基团加以修饰，以避免这些基团与以后被标 记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么， 将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交 斑，而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法 是用琉拍酸醉进行酸基化，将赖氨酸的氨基转 化成酞氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与 DNA的非特异结合。这一过程一般在15min 内结束。 2.4.4 变性处理 当封闭过程完成后，要立即 进行变性处理，即将整个载玻片立即浸入沸开 但不冒泡的水中，上下翻3^-5次，停留2min, 然后立即转到95%的乙醇中，浸泡一会儿后离 心干燥，这样便完成了对芯片上DNA的变性 处理。此时，整个基因芯片块也就做好了。 (待续) 2000年第35卷第7期 生 物 学 通 报 7 一