高效液相色谱法测定蓝芩口服液中黄芩苷的含量

www-zgys·org 科技交流 表2 酶处理法不同放置时间阳性对照 72 h生长情况 注：+表示有菌生长，一：表示无菌生长。 2．3 加酶处理 方法验证 Ⅱ 取样品10瓶，分别加无菌氯化钠溶液5 ml溶解，全部 转移至500 rnl无菌氯化钠溶液中作为样品液；采用三联式 开放式过滤器，先过滤于 0．1％无菌蛋白胨水溶液 100 rnl， 使滤膜润湿，再将样品液按规定量滤入滤器；用 0．1％无菌 蛋 白胨水溶液分别冲洗 300，400，500 ml(每次 50 m1)；取出 滤膜分别接种到硫乙醇酸盐液体培养基；在培养基中各入加 青霉素酶，硫乙醇酸盐液体培养基中分别加入金黄色葡萄球 菌 、大肠埃希菌 50～100 CFU。培养条件同方法验证 I。 加酶处理方法试验Ⅱ的结果显示，第一、二代头孢菌素 在冲洗量为 400 ml，培养基中加酶量为 2 ml时阳性菌有生 长，第三、四代头孢菌素在冲洗量为600 ml，培养基中加酶量 为4 ml时阳性菌有生长。而未加酶处理的试验对照组阳性 对照72 h均不生长。 3 讨论 《中国药典))2005年版规定 ，在 B一内酰胺酶类抗生素 无菌检查中，可通过加入适量 B一内酰胺酶(青霉素酶 )以消 除残留药物的抑菌活性。在试验过程中我们对青霉素酶的 加入方式进行了试验验证，青霉素酶与药物反应需要一定的 时间与温度 ，因此 ，加酶处理方法 I选择在冲洗液中加入青 霉素酶，并将酶溶液保留一定时问使酶与底物充分作用，让 p一内酰胺酶可裂解头孢菌素类抗生素的基本结构 p一内酰胺 环，以达到去除抑菌成分的目的。放置5 rain，第一、二代头 孢菌素样品管的试验菌在48 h有微弱生长，第三、四代头孢 菌素未见生长，说明酶与残 留的 B一内酰胺类抗生素作用时 间太短。放置 15 rain和30 rain，阳性对照在 72 h均能生长 (第一、二代头孢菌素样品管的试验菌在 24 h就有生长，第 三代头孢菌素在48 h均能生长)。为了缩短试验时间，提高 工作效率，可选择放置15 rain。加酶处理方法验证Ⅱ采用将 酶直接加入培养基中，这样操作起来简便、省时，但酶的用量 很大，考虑到以后降低试验成本，在两种方法均可行的情况 下，选择加酶处理方法 I。 根据不同代头孢菌素抗菌谱的差异，结合《中国药典》 2005年版规定的常用验证菌株⋯，确定抗 G 菌为主的药物 的无菌检查以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，抗 G一菌为主的 药物的无菌检查以大肠埃希菌为阳性对照菌。因此在 10种 头孢菌素种，注射用头孢拉定、注射用头孢呋辛钠、注射用五 水头孢唑林钠可选择金黄色葡萄球菌为阳性菌株；注射用头 孢曲松钠、注射用头孢噻肟钠、注射用头孢哌酮钠、注射用头 孢哌酮钠舒巴坦钠、注射用头孢他啶、注射用头孢米诺钠、注 射用盐酸头孢吡肟可选择大肠埃希菌为阳性菌株 。由于不 同头孢菌素具有不同抗菌活性和抗菌谱，因此所加青霉素酶 的量也不尽相同，第三、四代头孢菌素类主要以抗G一为主，对 B一内酰胺酶有一定抑制作用，青霉素酶的用量要大些。 由于头孢菌素抗菌活性强，试验中需要大量溶液冲洗滤 膜才能使阳性对照菌正常生长。我们也采用直接加大冲洗 量不加青霉素酶的方法来进行试验验证过，结果只有注射用 头孢呋辛钠、注射用头孢唑林钠在冲洗量为500 rnl时，所有 试验菌和阳性对照菌一起长出。其他几种抗生素 的样品管 的试验茵生长缓慢 ，注射用头孢噻肟钠、注射用头孢蓝松钠、 注射用盐酸头孢吡肟 的样品管的试验菌在 72 h内未见生 长。采用青霉素酶处理法后，第一、二代头孢菌素每筒冲洗 液的冲洗量可降到400 rnl，第三、四代头孢菌素每筒冲洗量 为 500 ml，试验菌在 72 h内均可见生长。这样不但能够减 少冲洗液的用量，还能提高工作效率，提高阳性检出率，确保 无菌实验结果的可信度。 参 考 文 献 1 中国药典[s]．2005年版．二部．附录：89 2 戴晕，刘鹏 ，马仕洪，等．简化注射用头孢菌素无菌检查法的探讨[J]．药物 分析杂志，2007 27(2)：208-211 (2007-09—10收稿 2008-01-02修回) 高效液相色谱法测定蓝芩口服液中黄芩苷的含量 韦丽华 路玫 苏小琼 (广西壮族自治区人民医院药剂科 南宁530021) 摘 要 目的：建立蓝芩口服液中有效成分黄芩苷的含量测定方法。方法：采用高效液相 色谱法，色谱条件：Luna C (250 mm×4．6 Inm，5 m)，流动相为甲醇一水一磷酸(45：55：0．2)；波长：280 nm；流速1．0 ml-rain～；柱温：30 。结果 ：黄芩苷 在0．8432—8．432 Ixg范围线性关系良好，黄芩苷的平均回收率为 97．16％，RSD为 2．22％(n=6)。结论：本方法简便、快速， 精密度和稳定性良好，可用于蓝芩口服液中有效成分黄芩苷的含量测定。 关键词 黄芩苷；蓝芩口服液；高效液相 色谱法 中图分类号：R927．2 文献标识码：A 文章编号：1008-049X(2008)07-0858-02 蓝芩口服液是由板蓝根、黄芩、栀子、胖大海、黄柏等药 材组成的复方中药制剂，具有清热解毒、利咽消肿之功效，临 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国药师 2008年第11卷第7期 China Pharmacist 2008，Vo1．11 No．7 床上主要用于急性咽炎、肺胃实热证所致的咽痛、咽干、咽部 灼热等。方中黄芩为常用传统中药，具有清热燥湿、泻火解 毒、止血、安胎⋯的功效，所含的黄芩苷是黄芩及其制剂的主 要质量控制指标成分，据药理学研究报道心 ，黄芩苷具有抗 微生物、抗变态反应、降压和镇静、利胆和解痉等作用。原口 服液质量简单，无黄芩苷含量测定方法。为了建立蓝芩 口服液的质量控制方法，我们参考有关文献 ，采用高效液 相色谱法测定该口服液中黄芩苷的含量。 1 仪器与试药 Waters液相色谱仪(Waters600泵，7725i六通阀，996二 极管阵列检测器 ，Millennium 32数据处理系统)。 蓝芩口服液(扬子江药业集团有限公司，批号：070403、 070504、070516、070531、070710)；黄芩苷对照品(中国药品 生物制品检定所，批号：0715-9708)；甲醇(优级纯)；其他试 剂均为分析纯。 2 方法与结果 2．1 色谱条件 色谱柱 ：Luna C18柱(250 i／ll,n×4．6 mm，5 I．zm)；流动相 ： 甲醇 水一磷酸(45：55：0．2)。流速 ：0．8 ml·min～，检测波长： 280 nm；柱温 30 。在该色谱条件下，黄芩苷的保留时间约 为 10 rain。 2．2 溶液的制备 2．2 1 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷真空干 燥24 h的黄芩苷对照品10．54 mg，置25 ml量瓶中，加 50％ 甲醇溶解至刻度，制成浓度为0．4216 mg·ml 的溶液，即得。 2．2．2 供试 品溶液的制备 精密量取蓝芩口服液1．0 ml， 置 10 ml量瓶中，加 50％甲醇稀释至刻度，摇匀，以0，45 I．zm 的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。 2．2．3 阴性对照溶液的制备 按处方制备不含黄芩药材 的口服液，同法制成阴性样品溶液，备用。 2．3 方法可行性考察 2．3．1 检测波长的确定 取对照品溶液进行紫外扫描。 由图谱可见黄芩苷在 280 nm波长处有最大吸收，故以280 nm为检测波长。取阴性样品、样品和黄芩苷对照品溶液，在 上述色谱条件下测绘 HPLC图谱见图 1。由图可知，阴性样 品对黄芩苷的测定无干扰，而且黄芩苷与其他组分可达到基 线分离。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12t mIn A B C A．黄芩苷对照品 B．样品 C．阴性样品 1．黄芩苷 图1 HPLC图 2．3．2 线性关系考察 精密吸取黄芩苷对照品溶液2，6， 8，10和20 l按“2．1”项下色谱条件进行测定，以黄芩苷对 照品溶液面积的积分值为纵坐标，进样量为横坐标，进行线 性回归，结果表明进样量在0．84～8．40 Ixg线性关系良好，回 归方程为 Y：3．234×10。X+8．641×10 (r：0．999 5)。 2．3．3 进样精密度实验 准确进样10 l黄芩苷对照品溶 液(0．42 mg·ml )5次，峰面积，计算其精密度，结果 RSD：0．53％(n：5)。 2．3．4 稳定性实验 每隔 1 h准确进样黄芩苷对照品溶液 10 l，经 4 h测定，结果峰面积 RSD：1．02％(n：5)。 2．3．5 重复性实验 平行吸取 6份样品(批号为 070516)， 按“2，3”项下方法处理后，进样10 l，记录峰面积，结果RSD ：1．56％ 。 2．3．6 加样回收实验 精密量取已知黄芩苷含量(1．6815 mg·ml～，批号070403)的供试品溶液1．0 ml，置 10 ml量瓶 中，分别加入定量的黄芩苷对照 品，用水稀释至刻度，共 6 份，依法进样10 l测定，计算黄芩苷回收率，结果见表 1。 表 1 黄芩苷回收率测定结果(n=6) 2．4 样品含量测定 精密吸取供试品溶液10 l，注入高效液相色谱仪，测定 峰面积，按外标法计算含量，样品中黄芩苷含量(n：6)，结 果见表 2。 表2 蓝芩口服液中黄芩苷测定结果 批号 ( 等 ) 批号 ( ) 070403 1．6815 O7O531 1．7285 O7O5O4 1．7586 07 071O 1．7066 O7O516 1．62l1 3 讨论 中药复方制剂，药味较多，成分复杂，干扰较大，不易测 定某一成分含量。本实验以黄芩的主要成分黄芩苷作为质 量控制，选用甲醇溶解样品，但色谱峰拖尾，加入0．2％磷酸， 可消除黄芩峰拖尾的现象分离效果好，柱效较高，以黄芩苷 峰计算可达2 000。 经加样回收试验及精密度试验，认为该含量测定方法可 作为蓝芩口服液的质量控制参考。 参 考 文 献 1 宋立人，洪恂，丁绪亮，等．现代中药学大辞典[M]．北京：人民卫生出版 社．2001．1865—1869 2 张建春，张华，施瑛，等．黄芩苷的研究近况[J]．时珍国医国药，2005，16 (3)：247-249 3 李晓梅，赵琪钟，卫舒帆．HPLC法测定清肺抑火片中黄芩苷的含量[J]． 中国药师，2007，1O(4)：358 (2007—12—17收稿 20084)24)1修回) 维普资讯 http://www.cqvip.com