高效液相色谱一质谱联用技术

第 26卷第 4期 2007年 4月 分析试验室 Chinese Joumal of Analysis Vo1．26．No．4 20Cr7—4 高效液相色谱一质谱联用技术 测定人血浆中的西替利嗪 喻凌寒 。，温预关 ，宋之光 ，牟德海 ，苏流坤 ，杨运云 (1．广东省化学危害应急检测技术重点 中国广州分析测试中心，广州 510070； 2．中国科学院广州地球化学研究所 有机地球化学国家重点实验室，广州 510640； 3．中国科学院研究生院，北京 100039；4．广州市脑科医院国家药品临床研究基地，广州 510370) 摘 要：建立了人血浆中西替利嗪的液相色谱．质谱联用测定方法。血浆样品调 至 pH 6，经 (乙酸乙酯)：V(CH2C1，)=4：1液 一液提取后 ，以 Agilent Zorbax SB — C (2．1 m／／l×150 m／／l i．d．，3．5 ffm)柱为色谱柱，流动相为 (乙腈)：V(1％甲 酸水)=55：45溶液，流速为0．5 mL／min，柱温：25 0C，进样量：5 ，在 Agilent 1100 LC／MSD XCT离子阱质谱仪上，以多重反应离子(nRn)方式进行定量分析， 用于监测的离子为 m／z 389—201(西替利嗪)和 m／z 515--"497(替米沙坦，内标 物)。西替利嗪的检 出限为0．50 ffg／L(S／N=3)，线性范围为 2．5～400 ffg／L，方 法回收率在 82．0％～86．7％之间 (／Z=5)，精密度与准确度符合生物样品分析 要求。该法可用于西替利嗪临床血药浓度和药代动力学研究。 关键词：西替利嗪 ；液相色谱．质谱法；药代动力学 中图分类号：0657．6；R969 文献标识码：A 文章编号：1000—0720(2007)04—073—04 盐酸西替利嗪(cetirizine hydrochloride)是第一 代抗组胺药羟嗪的活性羧酸衍生物，为选择性高 的第二代 H．受体拈抗剂，具有较强的抗过敏作 用，作用强而持久，能抑制肥大细胞脱颗粒，抑制 嗜酸细胞向过敏反应部位移动和对皮肤组织的浸 润，无明显的中枢抑制副作用。西替利嗪是第一 代 H1受体羟嗪的活性羧酸代谢物，在体内不易被 细胞色素P450所代谢，大部分经肾脏以原型药物 排出。目前已在国内外获准上市，临床主要用于 防治(季节性和非季节性)过敏性鼻炎、慢性特发 性荨麻疹、过敏性哮喘、特异性皮炎等疾病。 在此之前的研究中，测定人体内西替利嗪的 方法一般为高效液相色谱．紫外检测或荧光检 测l1 J，灵敏度低，达不到血浆中微量西替利嗪的 检测要求。此外紫外检测缺乏特异性，不能完全 排除内源性物质的干扰。因此本文在前人的研究 基础上，建立了测定人体内西替利嗪浓度的液相 收稿日期：2006—06—08；修订 日期：2006—08—23 作者简介：喻凌寒 (1976一)，男，师 色谱．串联质谱方法(HPLC．MS／MS)，检出限为 0． 50 ffg／L，并用于西替利嗪片剂在人体内的药代动 力学研究以及生物等效性研究。 1 实验部分 1．1 药品与试剂 盐酸西替利嗪品 (批号 040501)：纯度≥ 99．5％，浙江浙北药业有限公司提供；内标物：替 米沙坦对照品 (批号 030208)：纯度 ≥99．5％，北 京德众万全药物技术开发公司提供；乙腈 (色谱 纯，迪马公司)；水为重蒸去离子水；乙酸乙酯、 CH2Cl2、枸橼酸钠、枸橼酸均为分析纯，由广州市 化学试剂厂提供。 1．2 仪器 安捷伦 1100 LC／MSD XCT离子阱质谱仪，配 有电喷雾离子源及 Agilent ChemStations数据处理软 件，Agilent 1100高效液相色谱系统；电子天平(瑞 士 SARTORIUS)；XW一80A旋涡混合器(原上海医科 一 73 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 第26卷第4期 2007年 4月 分析试验室 Chi — n — e — se Journal of Analysis laboratory V01．26．No．4 200r7—4 大学仪器厂)；高速离心机(美国MICRO12—24)；真 空干燥箱(德国MMM—GROUP)。 1．3 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB—C18(2．1 mln x 150 mln i．d．，3．5／xrn)；流动相： (乙腈)：V(1％甲酸 水)=55：45溶液；流速：0．5 m]_Jmin；柱温：25 oC；进样量：5 。 1．4 质谱参数 离子源为电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压 (Capillary)5000 V；毛细管出口电压(Capillary Exit) 113．5 v；雾化气压力(Nebulizer)：3．10 X 105 Pa，干 燥气流量：9 L／min，干燥气温度：350 oC；离子化 模式：正离子化(positive)；扫描方式为多重反应监 测(MRM)。用于定量分析的离子分别为 m／z 389— 201(西替利嗪)和 m／z 515—497(替米沙坦)。 1．5 对照品溶液及内标溶液 准确称取盐酸西替利嗪标准品适量(相当于西 替利嗪 10．0 mg)，置 于 10 mL容量瓶 中，用 (乙腈)：V(水)=1：1混合溶液定容，即配制成 1．0 g／L的西替利嗪贮备液，贮存于4 cI=冰箱避光 保存备用。试验前按试验所需稀释成相应浓度的 标准工作液。另配制 100 tLg／L的内标替米沙坦乙 (a) 20 1 ．O ＼、【 ～ 。。H 166．1 371-2 f ⋯ l t 腈溶液。 1．6 血浆样品处理 取含药血浆 0．5—10 mL的带塞磨口玻璃锥形 离心管中，加入 100 tLg／L的替米沙坦乙腈溶液 50 ， 快速振荡 3 s，加入0．1 mol／L枸橼酸钠水溶液 (pH 6)0．5 mL，振荡 10 s，再加入 (乙酸乙酯)： (cH2C12)=4：1混合溶液 3 mL，密塞，旋涡振荡 2 min，3500 r／min下离心 5 min，吸取有机层置 3 mL的带塞磨口玻璃锥形离心管内，37 cI=真空干燥 箱中干燥至干。进样前加入 (乙腈)： (水)=1：1 混合溶液200 tLL，快速振荡 10 s使残渣溶解，3000 r／min下离心 5 min，吸取上清液 5 进样。 2 结果与讨论 2．1 质谱分析 西替利嗪和内标物替米沙坦在电喷雾离子化 方式下，主要生成[M+H] 准分子离子峰，分别 为 m／z 389和 m／z 515。对[M+H] 进行产物离子 扫描(见图 1)，生成的主要碎片离子分别为m／z 389---201(西替利嗪)和m／z 515—497(替米沙坦)， 将这些主要碎片离子作为定量分析时监测的产物 离子。 O0 200 300 400 500 600 1OO 200 300 400 500 600 m／z I~l／Z 图 1 西替利嗪 (a)和内标物替米沙坦 (b)的二级质谱图 ．1 The full MS-MS spectra of celirhfme(a)and telnfisartan(b) 2．2 方法专属性 分别取 6名受试者的空白血浆 0．5 mL，分别 按照上述的血浆样品前处理操作，进行分析。结 -- - - — — 74 ----—— 果表明空白血浆样品中内源性物质不干扰西替利 嗪及内标替米沙坦的测定。志愿者给药后采集的 血浆样品色谱图见图2。 2 8 4 O 8 6 4 2 O ， 0一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 26卷第 4期 2007年 4月 分析试验室 Chinese Journal of Analysis laboratory V01．26．No．4 200r7—4 2．0 1．5 。 0 l 0 O．5 O 0．5 1．0 1．5 2．0 2．5 3．0 3．5 0．5 1．0 1+5 2．0 2．5 3．0 3．5 m／Z m／z 图 2 多重反应监测模式下西替利嗪 (a)和内标物替米沙坦 (b)的离子流程图 Fig．2 Chromatograms of cefirizine and telmisartan(Is)by multiple reaction monitoring(MRM)scan mode．Blood pla~aa sample after intranasal administration 2．3 标准曲线和线性范围 取空白血浆 0．5 mL共 24份，分别加入0、25、 50、100、500、1000、2000和4000 t~g／L的西替利嗪 标准溶液 50 (1式3份)，振荡 3 s，使血浆药物 浓度相当于0、2．5、5．0、10．0、50．0、100、200和 40O t~g／L，然后按“1．6血浆样品处理”项处理。经 HPLC．MS／MS分析，以血浆西替利嗪质量浓度(10) 为纵坐标，药物西替利嗪峰面积与内标峰面积之 比(F)为横坐标，用最小二乘法进行回归分析，结 果表明血浆中西替利嗪质量浓度在 2．50～400 t~g／L范围呈良好的线性关系，回归方程及相关系 数分别为：P=44．04F+1．08，r=0．9993(rt=7)。 最低定量下限浓度为 2．50 t~g／L，平行对浓度 为 2．50 t~g／L的6个含药血浆样品处理后进行色谱 分析，其 提取 回收率平 均为 97．3％，RSD为 9．4％。检出限为0．50 L(S／N=3)。 2．4 回收率及精密度试验 按 2．3节分 别配制低 (5．0 L)、中 (200 g／L)和高浓度(300,g／L)的西替利嗪血浆溶液各 15份，分为3批，每批 5份，并与每批的标准曲线 同时进行检测，依“1．6血浆样品处理”项处理后进 行分析。同时将空白血浆，加入溶剂萃取处理后， 再加入相应浓度的西替利嗪和替米沙坦，按 1．6 节处理后，进样分析。以每一浓度两种处理方法 的峰面积比值计算提取 回收率，见表 1。结果表 明，本法的回收率稳定，能满足样品分析的需要。 表 1 LC—MS检测血浆中的西替利嗪的回收率与 日内、日间精密度 Tab．1 Recovery and precision of the LC—MS method for determination of cetirizine in human plasma 2．5 稳定性 按 2．3节分别配 制低 (5．0 L)、中 (200 ,g／L)、高浓度(300 t~g／L)的质控样品，每个浓度 6 样品分析，分为两组，每组每个浓度 3个样品。考 察了样品分别经室温放置24 h和48 h、一20 oC下 冻存 7 d和 14 d、冻融 3次的稳定性。不同浓度样 品检测结果的 RSD均小于 15％。 2．6 质控样品的制备和控制方法 按 2．3节分别配制低 (5．00,g／L)、中(200 ,glL)、高浓度(300,g／L)的血浆样品置 一2(】o【=冻 存备用。检测每批血浆样品前需做随行标准曲线， 并同时检测质控样品。结果表明随行标准曲线线 一 75 — 6 4 2 O ll{一一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 26卷第 4期 2OO7年 4月 分析试验室 Chinese Journal of Analysis laboratory Vo1．26．No．4 200r7—4 性良好，低、中、高 3个浓度质控样品的偏差均在 4-15％内，符合体内药物分析要求，本试验血浆样 品的测定结果准确、可靠。 2．7 在药代动力学研究中的应用 经医学伦理委员会批准，选择健康志愿者 20 名，空腹 12 h，分别1：3服西替利嗪 10 n1g，于给药 前0 h及给药后0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，2．5， 3，4，5，6，8，10，12及 14 h，经静脉留置针取前 臂静脉血5 roL1次，4 cc离心分离血浆，按“血浆样 品前处理”方法进行色谱分析。将受试者单剂量试 验后的血药浓度列表并计算均值及标准差，绘制 2 8 ￡ C 4 O o 2 4 6 8 l0 l2 l4 l6 t／h 图3 西替利嗪的平均血药浓度一时间曲线 Fig．3 Mean pla~na concentration-time curve of celJrizine after oral admlnistralion of a dose of 10 mg to 20 healthy volunteers 血药浓度 一时间曲线，如图 3所示。 3 结论 本文建立的 LC—MS方法，采用 MRM(多重反 应监测)扫描方式，同时对待测物的母离子和产物 离子进行检测，提高了方法的灵敏度和选择性(检 出限为0．50 L)，样品分析时间短。西替利嗪为 碱性化合物，本文考察了不同碱化试剂对样品回 收率的影响，发现血浆样品经 0．1 mol／L枸橼酸钠 水溶液碱化处理后，经 (乙酸乙酯)：V(CH2Clz) ：4：1提取，可获得稳定的提取回收率。同时，采 用乙酸乙酯 一CH2Clz混合提取溶剂，还易于操作， 缩短样品处理周期。 参考文献 [1] Chong-Kook Kim．Kyu Jeong Yeon et al1．J Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，37(3)：603 [2] J Moncfieff．Journal of Chromatography：Biomedical Appli— cations，1992，583(1)：128 [3] M T Rossel，R A Lefebvre．J Chromatogr：Biomedical Ap— plications，1991，565(1—2)：504 [4] A D de Jager，H K L Hundt et al1．J Chromatogr B，2002， 773(2)：113 [5] 孙 黎，刘晓琰，费艳秋等．医药导报，2003，22(1)： 15 [6] 姜云平，曾仁杰，吴苏澄等 ．中国医院药学杂志， 2002，22(5)：267 Determination of cetirizine and its pharmacokinetics in Human plasma after oral administration using LC—MS YU Ling-han ’ ， WEN Yu-guan ， SONG Zhi-guang ， MU De-hai ， 5 Liu-kun and YANG Yurt-)qtrt (1．Guangdong Key l aboratory of Chemical Emergency Test，China National Analytical Center，Guangzhou 5 10070； 2．State Key Laboratory of Organic Geochemi stry，Guangzhou Institute of Ge ochemi stry，Chinese Academy of Scien— ces，Guangzhou 5 10640；3．Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039；4．Department of Clinical Pharmacology，Guangzhou Brain Hospital，Guangzhou 510370)，Fenxi Shiyanshi，2007，26(4)：73～76 Abstract：A rapid and sensitive HPLC．MS method for the an alysis of cetirizine in human plasma after intranasal ad— ministration Was developed．Cetirizine and telmisartan(internal standard，IS)were extracted from plasma samples and chromatographied on a Agilent Zorbax SB—C18(2．1 rain×150 ln／n，3．5 tan)column and detected using a tandem mass spectrometer with an ESI interface，with a mobile phase of acetonitrile一1％ formic acid solution(55：45 by vol— ume)at a flow rate of 0．5 mL／min．An injection volume of 5 L Was used．Quantitaion Was performed using multiple reaction monitoring(MRM)of the m／z 389--~201 for cetirizine and m／z 515— 497 for telmisartan．The limit of quan— tification of the method for cetirizine Was 0．50 ptg／L．Th e analytical method for cetirizine is shown to be accurate，sen’ sitive and suitable for clinical phannacokinetic study of cetirizine． Keywords：Cetirizine：Pharmacokinetics；HPLC．MS 一 76 — 维普资讯 http://www.cqvip.com