胚胎移植

null胚胎移植胚胎移植一、胚胎移植技术概述一、胚胎移植技术概述胚胎移植是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种且生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。实际上是由产生良种胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的技术。 着床前早期胚胎的游离状态null能充分发挥优良母畜繁殖潜力。 羊每年自然繁殖：2－3只，胚胎移植：10－15只。 山羊繁殖 供体生产胚胎 受体妊娠分娩 后 代 null1890年 英国第一次兔获得胚胎移植成功 1934年 绵羊 1949年 山羊 1951年 猪 1951年 牛 1970年 马 1975年1月 美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会 80年代 欧洲使用MOET 奶牛育种胚胎移植历史null牛胚胎移植技术路线示意图null充分发挥优良母畜的繁殖潜力，加速品种改良，扩大良种畜群； 诱发肉牛产双胎； 可以代替种畜的引进和保存品种资源； 研究手段。胚胎移植的意义null目前，胚胎工程技术中应用最多的是胚胎移植技术，无论是转基因胚胎还是克隆等获得的胚胎，最后都必须经胚胎移植才能获得后代，胚胎移植是胚胎工程的最后一道“工序”。因此，可以说它是胚胎工程技术的基础。 null二、国内外发展概况 胚胎移植技术是20世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术。1951年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛，1976年，非手术法移植获得成功。null 国际间胚胎贸易非常活跃，早在1994年，全世界仅胚胎移植牛就已超过350，000头，其中进出口的胚胎约占总数的10%。羊胚胎年产总量虽较低，约为牛胚胎的5%-10%，但进出口比例更高。近年来，国际上胚胎的产量和贸易量则成倍增长。null 美国、加拿大、法国、新西兰、澳大利亚等发达国家成立了上百家胚胎移植公司；美国、法国等近年参加后裔测定的青年公牛中80%以上为胚胎移植的后代。牛冻胚移植的成功率达到了50%-60%。null世界牛胚胎移植现状（1） 1.近20—30年来，全世界每年生产牛胚胎约50--70余万枚，供体牛头均约6枚；其中北美洲约占40%，殴洲约占25%，亚洲只占10%，其它各洲占25%； 2.2002年，美国生产牛胚胎17余万枚，头均获可用胚7.5枚，其中肉牛占58%，奶牛占42%。鲜胚占34.7%,冻胚占64.3%；受胎率分别达到62.7%和50%,IVF胚胎受胎率达50%。出口胚胎6674枚（肉牛胚胎占52%，奶牛占48%）；null世界牛胚胎移植现状（2） 3.2002年，加拿大超排处理供体牛14427头，其中奶牛占78.48%,肉牛占21.52%,共生产胚胎95298枚,头均产可用胚6.6枚。胚胎冷冻62312枚；移植鲜胚27135枚、冻胚27511枚。性别鉴别鲜胚2433枚、冻胚1180枚，出口胚胎13664枚（中国占60.3%)。null国内牛胚胎移植的历史与现状 1978年手术移植奶牛诞生； 1980年非手术移植成功； 1982年冷冻胚胎移植成功； 1991—1995年间，全国年超排处理供体牛300—500头，移植1000余头； 1996—2000年间，年处理供体牛约500—1500头次，在肉牛、奶牛上分别移植受体4955、3926头，平均妊娠率达到51.5%。null 我国的胚胎移植技术经过了试验研究阶段（70年代初至80年代中）、发展提高阶段（ 80年代中至90年代中）与推广应用阶段（ 90年代中至现在）共3个时期，目前正向胚胎工程和产业化方向发展。 null流动实验车（新疆）null我国牛胚胎移植产业存在问 1.良种供体母牛数量不足； 2.操作熟练的技术人员严重缺乏； 3.受体牛的品质（健康、营养等）； 4.费用高，其成本主要由供体牛的饲养管理、人力（70%）以及药品、试剂和必要的仪器设备（30%）组成； 5.市场不规范。 null 发展前景 我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成。加上农业产业结构的调整，畜牧业发展的形势一片大好；胚胎移植技术作为扩大良种牲畜数量的一种最好手段，将在畜牧业生产中起到越来越大的作用，胚胎移植技术产业化前景十分广阔。 null 三、胚胎移植的基本原则移植前后所处的环境应是相同或相似的 移植的时间要适宜 胚胎的发育应当正常 null 1.供体和受体在种属上必须一致； 2.供体和受体在生理上必须一致：供、受体在发情时间上应同期化，一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降； 3.从供体中收集胚胎的部位与给受体移植胚胎的部位必须一致：即从供体子宫角内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫角内。（一）移植前后所处的环境应是相同或相似的null 胚胎收集与移植的时间不能超过周期黄体的寿命，因此，胚胎的收集时间不能超过发情配种后第7天，最好是在发情配种后的第5-7天内进行。（二）移植的时间要适宜null 胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响。同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植。 （三）胚胎的发育应当正常 null 四、胚胎移植技术路线供、受体牛的选择 供体的超数排卵与人工授精 受体的同期发情 胚胎的收集 胚胎的检查和评定 胚胎的移植 null（一）供、受体的选择null供体应是良种，而且为性状现优秀、具有较高育种价值与遗传优势的个体； 供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳； 供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。 供体母畜的选择null受体一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型； 受体要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同； 受体应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群。 受体母畜的选择null 在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称“超排”。(二)供体的超数排卵与人工授精null牛有PG法和CIDA法两种； 发情后9－13天开始； 常用的激素为FSH；注射一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时； 发情后8－12小时配种，间隔12小时再配种一次。 超数排卵方法nullnull 供体牛的超排：在发情周期第10、11、12、13天每头牛分别肌注FSH 160、140、110、90 单位，每天分两次注射，在第12天注射FSH的同时肌注PG，上午2支/头，下午1支/头。发情后供体配种2—3次。 nullEmtech Genetics LimitedSuperovulation ProgramBeef Cow ProgramFlush dateMarch 27, 1996ENSURE DONOR IS BLOOD TYPED PRIOR TO TRANSPLANTOwnerDonorheat set-up daySample Donor OwnerSample donor06-Mar9供体母牛注射下午上午下午上午下午上午下午上午332.52.5221.51.5cc Folltropin cc Folltropin cc Folltropin cc Folltropin cc Folltropin cc Folltropin cc Folltropin cc Folltropin cc Lutalysecc Estrumate7OR315-Mar16-Mar17-Mar18-Mar19-Mar20-Mar发情出现首次发情征状10小时后配种 12小时后再次配种下午受体母牛注射AM18-Marcc Lutalysecc Estrumate5OR2记录所有发情时间: 包括供体母牛和受体母牛（三）受体的同期发情（三）受体的同期发情 利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。 null缩短黄体期的前列腺素法(PG法) 延长黄体期的孕酮法 同期发情方法null PGF2α有溶解黄体的作用，从而引起发情，所以只对卵巢上存在黄体的受体有效。 在情期第9天以后，注射PGF2α，常可在注射后2-3天内发情。 对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔10-12天的两次注射法。 此方法方便可靠，但费用较高。 前列腺素处理法nulls母牛发情周期 第7-17天，对前列腺素（PG）有反应nullnull孕酮能够抑制腺垂体释放FSH，每日肌注或口服孕酮，或经阴道海绵栓给予孕酮或其类似物，一般处理12-18天后，可以抑制卵泡发育。停止处理或撤除海绵栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡发育，通常在2-3天内发情。 为了提高排卵的效率，在孕激素处理结束的前一天，可以给予小剂量的FSH。 此法费用低，但处理时间长。 孕激素处理法nullnull 1. 冲卵液和保存液的制作 冲卵液有很多种，目前最常用的为含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），也可用于体外短期保存胚胎。保存时间长或体外培养多用M-199液。D-PBS和M-199液或其他培养液一般都有成品出售。 (四) 胚胎的收集null 2. 回收过程 适宜于5--7日龄胚胎; 现均采用二通管非手术采卵法：用直肠把握子宫颈法插入带有探针的二通管直至一侧子宫角的基部，通过打气孔注入8--10ml空气,抽出探针，通过中心管道反复注入--回收冲卵液,连续5--6次。同样方法冲另一侧子宫角。null PBS集卵杯子宫颈 子宫角卵巢null 牛的非手术法回收胚胎 a.冲卵液 b.硬膜外麻醉 c.插入子宫中的Foley管 d.子宫颈null子宫角回收的液体较多，可以通过专用胚胎漏斗除去多余的冲卵液，在连续变倍解剖显微镜（实体显微镜）下进行检卵； 胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。 (五) 胚胎的检查和评定null 不同发育阶段的正常胚胎null未受精卵或异常胚胎nullA级;形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,透明带适中； B级;轮廓清晰,色调和细胞密度良好； C级;轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多； D级;轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液泡很多。 胚胎的分级标准null2-cell4-cell8-cell16-cellMorulaBlastocyst正常胚胎的形态null A 级 B 级 C 级D 级囊胚的分级null （六）胚胎的移植null重点应检查子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小），只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛，并详细记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧。 牛站立保定于六柱栏保定架内，用2%盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用18号针头，每只牛约5ml。受体母牛的准备 1.1ml注射器 2.装管接头 3.细管 A.棉塞 B.气泡 Ⅰ、Ⅲ、保护液 Ⅱ.含胚段装管器械和装管方法null胚胎的移植方法五、胚胎移植流程安排与组织五、胚胎移植流程安排与组织null 0天 3天 10天 0天 3天 10天 同期处理Ⅰ 发情 移植Ⅰ 同期处理Ⅱ 发情 移植Ⅱ 同期处理Ⅲ 每天检查处理100—200头备选受体，移植30—100头受体。 一个地区依次处理效率更高。牛冻胚移植11天1个循环的处理安排null 0天 3天 7天 10天 17天 同期处理 发情观察 移植 如果牛群较集中，每天可移植受体牛30-100头。从受体牛同期到冻胚移植一个周期需11天。合计用17个工作日，连续处理受体牛，移植300头以上受体牛是经济高效的安排。受体牛冻胚移植的高效时间安排null 0天 3天 12——15天 16天 23天 供体同期 发情 超排 AI 采卵 受体PGⅠ 受体PGⅡ 移植 如果牛群较集中，一组技术人员每天可供体冲卵5-10头，移植受体牛30-50头。从供体同期调整到供体冲卵和受体移植一个周期约23天。合计用约1个月的时间，连续处理30-60头供体牛，移植200-300头受体牛是高效的安排。供体受体牛鲜胚移植的时间安排null 1. 合格受体牛数量很有限 三低：可处理牛比率低 发情率低 可用率低 原因：饲养管理差 哺乳 公牛偷胚组织工作存在的问题null 2. 对胚胎移植技术认识不足； 3. 受体牛的组织不利； 4. 发情观察不可靠。 组织工作存在的问题null 建立集中饲养管理的胚胎移植受体群； 以县、乡为单位建立集中工作点; 根据受体牛情况高效安排移植工作； 严格筛选受体牛； 做好相关的技术宣传和。组织工作的对策 1. 供体母牛品种的选择 2. 受体母牛选择的策略 3. 超数排卵处理和药物选择 4. 同期发情处理的方法 5. 鲜胚移植与冻胚移植的选择 6. 国产胚胎与进口胚胎 7. MOET胚胎与IVF胚胎 8. 国内胚胎来源与付费方式 1. 供体母牛品种的选择 2. 受体母牛选择的策略 3. 超数排卵处理和药物选择 4. 同期发情处理的方法 5. 鲜胚移植与冻胚移植的选择 6. 国产胚胎与进口胚胎 7. MOET胚胎与IVF胚胎 8. 国内胚胎来源与付费方式牛胚胎移植技术推广应用的主要影响因素null附：山羊胚胎移植要点null山羊胚胎移植产业化null 超排方案1(FSH+PG法)：从供体发情周期的第9-13天开始注射FSH，以日递减剂量连续注射3天6次，每次间隔12小时,总剂量为150-300IU，在第5次注射FSH的同时肌注氯前列稀醇0.1毫克。 供体的超数排卵技术null 超排方案2(CIDR+FSH+PG法)：在发情周期的任何一天给供体阴道内放入CIDR，计为0天，然后于第9-13天任何一天开始肌注FSH，递减法连续注射3天共6次，在第5次肌注FSH时取出CIDR，并肌注氯前列稀醇0.1毫克，一般在取出CIDR后24-48小时发情。 null (1)术前准备 场所、器械和人员的准备 供体羊的术前准备：术前1日停止喂食但不停水；术部剃毛；麻醉现多用速眠新处理；术部皮肤先用2%-4%的碘酒消毒，晾干后再用70%-75%的酒精棉涂擦脱碘。将创巾固定在术部周围并露出术部。 胚胎的回收null (2)手术过程 皮肤用外科刀一次切开，4—6厘米。肌肉用钝性分离的方法沿肌纤维的走向分层切开，最后切开腹膜。注意及时止血。 手术者将食指及中指由切口伸入腹腔触摸子宫角，用二指夹持，因势利导地牵引至创口表面，先循一侧的子宫角至该侧的输卵管，在输卵管的末端弯转处找到该侧的卵巢， 观察卵巢表面的排卵点和卵泡发育情况并做记录。null （3）冲洗输卵管法 适宜于2--3日龄的胚胎。 将一根长5-7cm，外径3-4mm的硅胶管插入输卵管喇叭口内1-1.5cm，用血管夹或手固定固定。以左手母指和食指捏住子宫角前端，右手持吸有冲卵液的针管并将针头插入子宫角尖端，注入冲卵液约10—15ml。 输卵管回收胚胎示意图 输卵管回收胚胎示意图null （4）冲洗子宫法 适宜于5-7日龄胚胎。 子宫角回收胚胎示意图(1) 子宫角回收胚胎示意图(1) 子宫角回收胚胎示意图(2) 子宫角回收胚胎示意图(2)null 用作受体的母畜应具有明显的发情症状，发情时间应与供体母畜一致。羊采用手术法移植。 胚胎的移植null 受、供体同时做好术前准备，在进行胚胎检查的同时或之后，立即在受体母畜腹部做一切口，轻轻拉出子宫角，找到排卵侧的卵巢并观察黄体数量与发育情况。null 只有黄体发育良好的受体才能用于胚胎移植，黄体过小、发育异常或退化的受体都不能用于胚胎移植，否则很难受孕。卵巢上有1个黄体的受体一般只给移1枚胚胎，有2个或2个以上黄体者可以移2枚胚胎。null 根据胚胎的发育阶段以及回收与移植部位一致的原则，用移植管将胚胎注入黄体同侧子宫角前端或通过喇叭口送至输卵管壶腹部（如图），然后迅速复位、缝合。注意：保护受体卵巢黄体。 山羊手术法移胚 A.子宫移胚器 B.子宫角移胚 C.输卵管移胚 1.移植针 2.硅胶管 3.吸有胚胎的细管 山羊手术法移胚 A.子宫移胚器 B.子宫角移胚 C.输卵管移胚 1.移植针 2.硅胶管 3.吸有胚胎的细管 麻醉、固定麻醉、固定 刮 毛 刮 毛消毒消毒 供体的手术 供体的手术 超排后的黄体 超排后的黄体 非正常的卵巢：大卵泡 非正常的卵巢：大卵泡 供体的冲胚 供体的冲胚 检 胚 检 胚 移植胚胎 移植胚胎 缝 合 缝 合 供体受体的解麻 供体受体的解麻 受体与产的羔羊 受体与产的羔羊肉羊基地与胚胎移植产业化肉羊基地与胚胎移植产业化扬中市种羊场 如东县种羊场 睢宁波尔种羊场 丰县合作种羊场 苏州湖羊种羊场 东台新街种羊场 常州新世纪农业园 萧县恒发牧业公司 睢宁南非波尔种羊场 如皋天顺恒牧业公司 南京农业大学 动物胚胎工程技术中心 2002年8月5日，时任江苏省省委书记的回良玉副总理视察睢宁基地—睢宁波尔种羊场。 2002年8月5日，时任江苏省省委书记的回良玉副总理视察睢宁基地—睢宁波尔种羊场。 　 　 南京农业大学动物胚胎工程技术中心常州基地2003年9月4日降生的良种胚胎移植牛2003年9月4日降生的良种胚胎移植牛 （江苏省农业三项工程项目） 受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛 （江苏省农业三项工程项目） 美国胚胎移植协会专家来访美国胚胎移植协会专家来访null 谢 谢