干细胞移植血管新生治疗糖尿病足的研究

干细胞移植血管新生治疗糖尿病足的研究 随着糖尿病发病率的增加和人均寿命的延长，糖尿病的慢性并发症尤其是糖尿病足的患病率也明显增加，其病程长、治疗难度大、致残及致死率高，己成为糖尿病最常见而严重的并发症之一。糖尿病足尚无有效治疗手段，药物治疗收效甚微，对于下肢动脉流出道闭塞而且缺乏侧支循环形成的患者，介入治疗和血管搭桥等血管再通技术存在着一定的局限性。近年来，血管内皮祖细胞(endothehal Progenitorcell，EPC)的发现及干细胞的分离、纯化方法的不断改进，使采用干细胞移植血管再生技术重建有效的侧支循环成为可能，为糖尿病足的临床治疗带来新的希望。 1、EPC与血管内皮细胞(endothelialeell，EC) EPC是指机体中存在的能特异性归巢于血管新生组织并分化成EC的一群干细胞亦即EC的前体细胞。胚胎发育过程中的EPC和造血干细胞(HSC)共同起源于胚外中胚层卵黄囊血岛，由原血干细胞(hemang1oblast)即血管干细胞或称为成血管细胞(angioblast)分化发育而来。在小鼠胚胎发育模型上，受精卵形成后约第七天，胚外中胚层细胞聚集形成卵黄囊血岛，12小时后，聚集细胞群的中央细胞分化为HSC而包绕血岛的外周细胞则分化为EPC。受精后约2周时，位于中心部位的HSC分化为血球系列形成血液，而位于边缘部的EPC分化为EC进一步形成原始血管壁。基于EPC和HSC表达共同抗原及其在胚胎发育过程中空间和形态上的紧密联系，研究者认为EPC和HSC可能存在共同的前体，即一种具有双重分化潜能的原血干细胞，在一定的条件下它既能发育为HSC也能分化为EPC。 以前认为EPC仅仅出现于胚胎血管发育阶段，在出生后的机体内并不存在。Asahara等于1997年首次成功将成人外周血中分离出的CD34+单个核细胞载体外诱导分化为EC，在动物体内证明其生成血管的能力，并认为这种CD34+细胞即可能为EPC。随后，又在骨髓和脐血中得到类似发现。Asaharals等通过鼠的同种异体骨髓移植模型证实了成年个体外周血中的EPC来源于骨髓，是CD34+细胞的一个亚群。由于外周血中同时还存在着EC，而EC和EPC在形态和抗原表达方面具有相似性，因此对于外周血中的EPC是否就是EC一直存在争论。近年来的研究显示:与EC相比，EPC同时表达VEGFR-2、AC133(CD133)及CD34，AC133是人类造血干细胞的标记抗原，而VEGFR-2是胚胎干细胞向内皮细胞分化过程中最早表达的内皮标记。同时EPC具有更高的分化潜能，并促进出生后血管发生，主要存在于骨髓。随着EPC向成熟内皮细胞的分化，AC133的表达逐渐下降，外周血成熟的内皮细胞不表达AC133。可以利用这些特征区别EPC和EC，并可以利用这些内皮特异性标记来富集纯度较高的EPC。 2、EPC与血管新生 血管新生主要有两种方式:(1)血管发生(vasculgenesis)，即在胚胎发育中的新生血管形成(neovaseularization)时，由中胚层来源的成血管细胞(angioblast)原位分化为EPC及EC，然后在原位形成原始的毛细血管网；(2)血管生成(angiogenesis)，是指从己存在的血管上出芽方式长出新的毛细血管的过程，即通过存在的EC迁移、增殖、重塑来形成新的血管。以前一直认为成年人血管的修复依赖于血管新生，EPC的发现提示成人也存在EPC参与的血管发生。 EPC参与的血管形成无需依赖原有的血管系统，通过EPC在血管生长的原位分化为成熟内皮细胞并组织成血管的过程，类似于胚胎时期的血管发生过程，又称为出生后血管发生(postnatal vaseulogenesis)。由于高血压，糖尿病，高血脂，动脉粥样硬化、吸烟及年老等因素可以降低患者循环中EC的数量和活性，使细胞因子介导的血管生成的临床应用受到限制。而EPc介导的血管发生则不受EC和原有血管的影响。同时EPC本身具有分泌血管内皮生长因子(VEGE)等细胞因子的能力，有利于新生血管的形成。 3、EPC移植血管新生在精尿病足治疗中的应用 Isner等首先提出了“治疗性血管形成(therapeutievaseulogenesis)”的概念，倡导补充EPC数量来达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病。研究表明，高糖可减少EPC数量，抑制其增殖潜能、乳附和成血管能力并呈浓度和时间依赖性，这为糖尿病侧支血管形成受损机制提供了体外实验依据。schatteman等发现，输注外源性EPC能改善糖尿病小鼠的血管形成能力，促进糖尿病小鼠缺血肢体的血流恢复。 近年来，Tat1ana等对人体骨髓内和外周血中的单个核细胞(MNC)转化为EPC的潜能进行了研究，结果发现在不同培养条件下骨髓和外周血中的MNC可以转化为EPC，解决来源于骨髓和外周循环中EPC数量过少的问题。同时，密度梯度离心和利用覆盖有抗CD133或抗CD34抗体标记的免疫磁珠及白细胞缩减滤器等分离EPC的方法的使用使得富集高纯度的EPC成为可能。这些在EPC动员及分离纯化技术的研究进展为EPC的临床应用提供了有利条件。 3.1骨髓来源的EPC移植研究显示，糖尿病足及其他外周动脉闭塞性疾病患者因其骨髓和外周血中E代特异分子的表达低于正常，其血管发生潜力也很低，并因此可以导致难愈性臻疡和持续性下肢损伤。自体骨髓单核细胞移植治疗可以增加其血管内皮祖细胞数株，并改菩临床症状。shi等利用免疫磁珠分离出人骨髓CD34+单个核细胞，在VEGE及纤维母细胞生长因子(FGF)等的作用下分化为EC，并进行了狗的同种异体骨髓干细胞移植术，证实了骨髓来源的EPC在体内能促进新生血管的形成。2002年Tateishi等在国际上率先报道了应用骨髓干细胞移植治疗周围血管病患者的临床，接受自体骨髓单个核细胞移植治疗的43例下肢动脉缺血性疾病患者均获得了满意的疗效，且未发现任何明显的移植相关不良反应。国内谷涌泉等应用骨髓造血干细胞移植治疗糖尿病足(13例患者巧条下肢)也获得了较好的效果，首先抽取自体骨髓35Oml，从中分离出单个核细胞悬浊液约40ml，在硬膜外麻醉或腰麻下，将干细胞混悬液多点肌肉注射到缺血下肢，每点0.8～lml，各点间距约3cm X 3cm。所有接受移植的患者临床症状都有不同程度的改善，7例患者的8条下肢在术后1～3月进行了动脉造影发现均有不同程度的侧支血管形成，80%的患者达到了避免截肢或降低截肢平面的目的。但由于骨髓采集需要全身麻醉，对患者的全身要求较高，且骨髓采集量大(约500ml)，患者不易接受，使临床应用受到一定的限制。 3.2脐血来源的EPC移植以前研究认为源于脐血的内皮祖细胞较其他来源的着更高的增殖潜能和更高的细胞循环率，提示脐血来源的内皮祖细胞对于血管发治疗更有效，并运用脐血来源的内皮祖细胞血管再生治疗免疫缺陷的裸鼠的肢端血取得成功。但在临床应用的疗效上却存在着争议。KeikoNaruse等首次证明脐血来源的单核细胞移植对于治疗糖尿病血管神经病变是有益的，通过组织学研表明，注射部位的骨骼肌血管增多，并且没发现严重并发症。而KojiYalnajnot等在进行不同来源的干细胞移植的对照研究中发现脐血来源的单核细胞的内皮祖细胞特异性分子的表达低于骨髓和经G-CSF处理过的外周血，提示脐血没有足够的血管新生潜力以供临床应用；经G-SF处理过的外周血与骨髓相似。提示外周单核细胞由患者体内分离后经G-CSF处理可能成为一种可供选择的替代骨髓的来源。 3.3外周血来源的EPC移植2003年Keiji首次进行自体骨髓干细胞移植(BMSCT)和自体外周血干细胞移植(PBSCT)治疗糖尿病周围血管性疾病的临床对照结果显示，自体骨髓单核细胞移植可以有效增加缺血肢体的血管再生，有良好的临床应用前景，而自体外周血单核细胞移植没有确切疗效。但同年黄平平等采用自体外周血干细胞移植治疗1例下肢动脉硬化性闭塞症取得显著疗效，使这例患者避免了截肢的后果。随后黄平平等又对43例糖尿病下肢缺血患者进行了随机对照研究，移植组先予皮下注射rhG-CSF600µg/天共5天以动员祖细胞分化，搜集外周血单核细胞，于缺血肢体40个点肌肉注射，每点注射0.75ml，注射深度一般为1～1.5cm间距为3cmX3cm，移植12周后随访发现，移植组所有患者临床症状均有不同程度改善，足溃疡的痊愈率为77.8%，下肢动脉造影示血管新生率76.9%，无一例截肢与对照组(常规治疗组)有显著差异。杨晓凤等以同法对88例下肢缺血性疾病患者(其中60例为糖尿病足患者)进行PBSCT，移植一月后超过90%患者临床症状缓解，足溃疡或坏疽愈合或好转，约50%患者的跺肮指数和经皮氧分压明显改善，7例DSA下肢动脉造影结果显示新侧支血管形成明显增加，2例糖尿病足合并脑梗死患者在干细胞动员期间症状加重，经治疗好转，其余患者未出现并发症和明显不良反应，总疗效与分MSCT相比无明显差异。国外AkioKawamura等也对30例糖尿病肢端缺血进行了PBSCT，有效率为73%。这表明G-CSF诱导外周血单核细胞移植治疗糖尿病患者肢端缺血是一种新的、简单、安全、有效的方法。 外周血EPC移植治疗应用的一个主要限制是外周循环血中的EPC数目低，研究显示健康者体内早期循环血CD133+/CD34+/VEGFRZ+EPC仅占外周血单核细胞的0.002%左右。体内外诱导扩增是解决外周循环血中EPC数目过低的常用方法。许多外源性动员剂，如粒/巨噬系集落刺激因子(G/GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素1(angiopoietin-l)、促红细胞生成素(EPO)、他汀类药物、雌激素、基质来源因子1(SDF-1)和血管紧张素II等。都可在体外诱导骨髓来源的EPC形成，临床常用的为G/GM-CSF及vEGF。自Dan1el等报道了用逆转录病毒转染EPC是一种安全有效的基因转移方法，从而为EPC基因修饰治疗开辟了一个新途径。研究发现，VEGF基因体外转染EPC可显著增加EPC增殖、薪附功能，从而使在达到同等促血管新生作用的同时减少EPC的使用数量，增加其临床可行性。用腺病毒编码的VEGF165转导的异源EPC移植不仅促进新血管生成和血流恢复，同时，转导的人vEGF局部自分泌促进血管新生，是基因修饰EPc的双重作用。但是，这种方法的临床应用要谨慎，因为用腺病毒编码的VEGF165基因的过度表达在动物模型中诱导了血管瘤的形成。 糖尿病足患者中绝大多数为中老年人，大多合并高血压、高血脂，为心脑血管疾病的高发人群，干细胞动员过程中外周血白细胞在3～5天内急剧增多，血液呈高凝状态，发生意外的可能性要明显高于正常人群。临床实践显示，动员期间急性血栓形成及心脑血管意外的发生率不足5%，主要发生于外周血白细胞高于40x109/L时，为防止动员期间心脑血管意外的发生应注意:1)积极控制血糖、血压及血脂，合并冠心病、脑梗塞患者积极应用药物加以治疗，密切观察病情变化，并监测血压、血糖、血脂等相关指标。2)适当使用抗凝剂，可同时给于低分子肝素S000u/d皮下注射，或者1000Ou/d静脉滴注。3)动员剂剂量适当。4)每日检测外周血白细胞总数。5)把握干细胞分离及采集时机，一般为动员4～5天，每日监测外周血白细胞总数和临床表现变化，外周血白细胞总数升至(40～50)x109/L左右时采集，出现血栓形成和心脑血管并发症迹象时可提前采集，但也应在30x109/L以上，并在分离采集时适当加大循环血量。 综上所述，自体骨髓EPC和外周血EPC移植血管新生技术是治疗糖尿病足的一种简单、安全、有效的新手段。尤其对于下肢远端动脉流出道闭塞不宜行血管搭桥术以及由于年老体弱或伴有其他疾病不能耐受血管搭桥术的患者，可以通过自体骨髓EPC和外周血EPC移植血管新生技术建立有效的侧支循环，使患者改善临床症状，避免截肢或者降低截肢平面，提高生活质量。但作为一种新疗法，EPC移植血管新生治疗糖尿病足还存在许多问题，如移植的适应症及最佳时机的选择、EPC在缺血组织的增殖潜能及其影响因素、移植后新生血管再狭窄的预防等尚有待进一步研究。另一方面，由于其应用于临床的时间尚短，临床中样本量都很小，观察时间短，EPC移植血管新生技术治疗糖尿病足的长期疗效还需要进一步观察。