CIK和IL-2对人甲状腺癌细胞甲状腺激素分泌功能影响的实验研究

解放军医学杂志 2007年5月 第 32卷 第 5期 Med J Chin PLA Vol 32 No 5 May 2007 · 457 · CIK和 IL-2对人甲状腺癌细胞甲状腺激素分泌功能影响的实验研究 陈健鹏 罗荣城 丁雪梅 栾亦 李爱民 郑大勇 梁卫江 刘翠萍 【摘要】 目的 通过体外实验研究 CIK细胞和IL-2对人体甲状腺乳头状癌细胞甲状腺激素 、．r1分泌功能的影响。方法 取甲状腺乳头状癌患者手术切除组织，分离肿瘤细胞，培养 3天后，以不同浓度的IL-2(500、2 000、8 000、16 000U／m1)和CIK细胞(与 癌细胞的比例为 100：1)分别或联合刺激 4次，每次刺激时间为 72h。以放免法测定 T{、rrl水平，MTT法测定细胞增殖情况。结果 高浓度IL-2能明显降低甲状腺癌细胞T、、T 分泌能力，而中低浓度 IL-2对 、T 分泌无明显影响。CIK联合 IL-2可以显著抑制癌 细胞生长，增强 CIK杀伤能力。结论 高浓度 ID2对甲状腺乳头状癌细胞增殖无明显影响，但能抑制其 、rr1分泌功能，有别于 CIK细胞对甲状腺癌细胞的杀伤机制。 【关键词】 甲状腺肿瘤；细胞培养；三碘甲状腺原氨酸；甲状腺素 【中国图书资料分类号】 R736．1 Effects of cytokine-induced kill cell(CIK)and IL-2 on the secretion of thyroxine by thyroid papillary carcinoma Chen Jianpeng，Luo Rongcheng，Ding Xuemei，et a1．Center of Oncology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China [A~tract] Objective To investigate the therapeutic mechanisms for differentiated thyroid cancer by using CIK and IL-2，to find out the better adjunctive clinical therapies for thyroid cancer patients after operation，and to evaluate the effects of cytokine-induced kill cell (cIK)and ID2 on the secretion of thyroxine by thyroid papillary carcinoma．Methods The samples of thyroid papillary carcinoma were taken from the excised tissues of patient with thyroid cancer，and then dispersed wi th collagenase and trypsin for culturing．The carcinoma cells were then seeded in 24一well cell culture plates at 37~C，5 0 and 95 humidity for 3 days．At the fourth day，the cells in the wells were separately stimulated four times with different dosage of CIK and IL-2，and the stimulation lasted for 72 hours each time 12 days later，the solution of rr{，Ti was detected wi th radio-immunity kits，TSH was detected with immun o-radiation kits，and the cell proliferation was detected with mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay．Results The thyroid cancer cells did not respond to IL-2 in median and low concentrations，but responded to IL-2 in a higher concentration which ma y depress the secretary function of thyroid cancer cells．IL-2 of high concentrations can obviously decrease the hormone secretion，such as Thyroxine and Thyrotropin，of papillary carcinoma ，and improve the CIK's ability of killing cancer．CIK can kill the cancer cells only when companied with ID2．Conclmion IL-2 of high concentrations can't inhibit the proliferation of thyroid cancer cells，but can depress the secretary function of thyroid cancer calls， which is different from the killing mechanism of CI K． [Key words] thyroid neoplasms ；cells culture；triiodothyronine；thyroxine 目前临床上对 甲状腺癌的研究较少，治疗多采用 手术+术后单一的内分泌治疗。南方医院肿瘤中心从 提高患者自身免疫力出发，对部分甲状腺癌患者除进 行内分泌治疗外，还联合应用 CIK+IL-2的生物治疗 方法，取得了良好的效果。我们在临床工作中还发现， 这部分患者的 、rr4水平出现了明显变化。为进一步 明确 CIK+IL-2生物治疗的可能机制及对甲状腺癌细 胞甲状腺激素分泌功能的影响，我们采用体外试验的 方法对其进行了研究，现报道如下。 1 材料与方法 1．1 组织来源 实验标本为手术切除组织 (患者女 性，52岁，为原发癌灶 ，无淋 巴结转移，原发癌包膜完 整，选择组织无坏死区域)，术中冷冻切片提示为乳头 状癌，最终经石蜡切片证实。切取肿瘤组织部分，置于 无菌瓶中，以不含 Ca 、 。的 Hanks液保存。 1．2 甲状腺癌细胞原代培养 去除肿瘤标本的包膜 及周围甲状腺组织，漂洗后剪成约 lmm×lmm×lmm 大小的碎块；以含 25ou／mlⅡ型胶原酶、0．25 胰蛋白 酶的消化液与剪碎 组织按 5：1(体积 比)混合消化 60min，200目不锈钢筛过滤，D-Hanks液漂洗 2次，1 500r／min离心 5min，弃上清，加入含 15 胎牛血清、 100U／ ml青霉素、100U／ ml链霉素、1OU／L普通人胰岛 素、2mmol／L谷氨酰胺的 DMEM培养液，采用 Ficoll 法离心(1 500r／min，5min)纯化，去除全部红细胞和部 分杂细胞，再次加入上述配好的 DMEM液 5ml，吹打混 匀，计数并观察细胞活性。将所获细胞加入含 2O 新 生牛血清的 DMEM 培养液中，吹打制成细胞悬液，按 2×10 ／ml接种于 24孔板，置 37℃、95 湿度、5 C 孵箱中培养 72hl_1 。 1．3 CIK及 Ib2刺激试验 上述细胞培养 72h后，分 为 7个实验组 ：①单纯 CIK细胞组；②CIK细胞+Ib2 【作者简介】 陈健鹏，住院医师，硕士生。主要从事肿瘤生物免疫治疗 方面的研究 【作者单位1 510515 广州 南方医科大学南方医院肿瘤中心(陈健 鹏、罗荣城、丁雪梅、李爱民、郑大勇、梁卫江)，中医风湿科(栾亦)；江苏 省人民医院内分泌实验室(刘翠萍) 【通讯作者】 罗荣城，电话：02％61641651 维普资讯 http://www.cqvip.com · 458 · 解放军医学杂志 2007年 5月 第 32卷 第 5期 Med J Chin PLA Vol 32 No 5 May 2007 组；③IL-2低浓度组；④IL-2中低浓度组；⑤IL-2中高 浓度组；⑥IL-2高浓度组；⑦空白对照组(简称对照 组)。每组设 3个复孔。单纯 CIK细胞组中每孔每次 加入 1．25×l0。个 CIK细胞(按临床治疗要求，CIK细 胞：癌细胞：100：1)，CIK细胞+IL-2组中CIK细胞数 同单纯CIK细胞组，IL-2每孔每次给药浓度为5oou／L (按普通人每日100万 U剂量计算)，IL-2低～高浓度 组每次 IL-2给药浓度分别为 500、2 000、8 O00U及 16 000U／L。每培养 72h换一次全液并给药(分别为细 胞开始培养的第4、7、l0、l3天)，给药后加含 20 胎牛 血清的DMEM培养液至 2ml／~L。在每次给药之前及 实验结束的第 l6天收集更换的培养液进行 、T4测 定(共收集 5次)，试剂盒为北京科美东雅生物技术有 限公司产品。开始给药到试验结束试验时间为 12天。 1．4 MTT法测定细胞增殖情况 上述刺激试验结束 后，弃去各个试验组培养板中上清，每孔加入 M丌 20肛l，37℃培养箱中培养 4h，小心弃上清，每孔加二甲 亚砜200~1，微量振荡器振荡 5rain，酶标仪测定490nm 处的吸光度值，细胞存活率一实验组 OD值／空白组 OD值×100 。 1．5 统计学处理 数据结果以 ±5表示，组问比较采 用SPSS 10．0软件行定量数据重复测量的方差分析。 2 结 果 2．1 CIK细胞和 IL-2对甲状腺癌细胞分泌功能的影 响 刺激前各组 、T4水平与对照组比较无显著性差 异(Pl>o．05)。刺激后 CIK细胞+IL-2组和 IL-2高浓 度组 、T4水平明显低于对照组(P<0．05)，而其余各 组与对照组比较无显著性差异(P>o．05，表 1)。 表 1 CIK细胞和IL-2对甲状腺癌细胞分泌功能的影响(n一3) ．BIbk 1 Effects of the CIK and IL 2 on the secretary function of thyroid carcinoma cells(n一3) 注：与对照组比较，(1)P<0．05 2．2 CIK细胞和 IL-2对甲状腺癌细胞增殖的影响 单纯 CIK细胞组、CIK细胞+IL-2组、IL-2低浓度组、 IL-2中低浓度组、IL-2中高浓度组、IL-2高浓度组、对 照组的细胞存活率分别为 0．79、0．39、0．95、0．96、0．90、 0．89、1．OO，除 CIK细胞+I 2组外(P<0．001)，其余 各组与对照组比较均无显著性差异(P>0．05)。 3 讨 论 免疫细胞过继疗法已成为肿瘤患者术后及放化疗 后辅助治疗的重要手段之一，对促进免疫系统重建、消 除残留病变及骨髓净化均具有良好效果。CIK细胞兼 具 T淋巴细胞强大的抗瘤活性和 NK细胞的非 MHC 限制性杀瘤特点，已广泛应用于各种肿瘤，尤其是各种 实体瘤的治疗和预防_3 J。近年来，随着 CIK细胞联 合IL-2生物治疗技术的逐渐成熟，国外越来越多的生 物治疗中心开始采用 CIK细胞+高浓度 IL-2(可达传 统治疗浓度的几十倍)的治疗模式 ，其中 CIK细胞是杀 伤肿瘤细胞、提高机体免疫功能的主要效应细胞，而 IL-2则起到保持和提高 CIK细胞效应的作用_5 J，本 实验亦证实了这一点。 目前有关 IL-2的研究多集中在其辅助淋巴细胞 的间接抗肿瘤作用上，而对其对某些癌瘤组织的直接 作用研究较少。本研究发现，在高浓度 IL_2的影响下， 甲状腺癌细胞的T{、T|分泌水平明显下降，但本实验 同时用MTT法对各组细胞增殖情况进行测定，发现高 浓度的IL-2并不能显著抑制甲状腺癌细胞的增殖。该 结果提示，IL-2和CIK的作用机制不同，前者并非通过 杀伤细胞或抑制细胞增殖使得 T{、T4下降，而是直接 抑制癌细胞的 T{、T4分泌功能。 本实验还提示我们，临床治疗过程中应严密监测 那些生物治疗疗效较好的甲状腺癌患者甲状腺功能的 变化，在生物治疗辅助术后内分泌治疗的同时观察两 者间的互相影响，并根据实际情况对其进行适当调整。 【参考文献】 [1] 刘翠萍，刘超，张忠邦，等 ．人甲状腺细胞的培养和功能研究及其 应用 ．标记免疫分析与临床，1994，1(4)：213 E2] 沈美萍，武正炎，侯馨德，等．人甲状腺乳头状癌细胞对牛一TSH和 去甲肾上腺素反应性的实验研究 ．南京医科大学学报，2000，20 (1)：20 [3] Scheold C，Brandt K，Johnston V，et a1．Potential of autologous immunologic~ ector cells for bone nlarrow purging in patients m chrorfic myeloic leukemia．Bone Marrow Transplant，1995，15：33 [4] Sehmidt-Wolf IG，Lefterova P，Johnston V，et a1．Sensitivity of multidrug-resistant tumour call lines to immunologic effector cell~ Cdl Irnmunol。1996。169(1)：85 r5] Zol1 B，Lefterova P，Ebert 0，et a1．Modulation of cell surface markers onNK likeTlymphocytes by usingIL-2，I 7 orIL-12 in ￡r0 stimulatiorL( 0 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