余立－抗生素检测基础知识

null抗生素检测基础知识抗生素检测基础知识北京市药品检验所 余立一.抗生素的定义一.抗生素的定义1929年Flemming发现第一个抗生素-青霉素 1942年链霉素的发现者Waksman定义：抗生素是微生物在代谢中产生的具有抑制其他微生物生长活动、甚至杀灭其他微生物的化学物质。 由于抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现及合成工业的迅速发展，抗生素现在被定义为：“在低微浓度即可对某些生物的生命活性有特异抑制作用的化学物质的总称。” 二.抗生素与常规化药在理化性质上的差异二.抗生素与常规化药在理化性质上的差异1.存在多组分品种，纯度较低 经典的抗生素由发酵生产，通常为多组分，没有95%以上的主组分。如：庆大霉素、乙酰螺旋霉素、制霉素 二.抗生素与常规化药在理化性质上的差异（续）二.抗生素与常规化药在理化性质上的差异（续）国内的制霉素和国外的制霉菌素均为多组分的混合物，但国外的制霉菌素主要成分为制霉菌素A1，含量在80%左右；国产制霉素用高效液相色谱法可分离出8～10个色谱峰，其中主要组分为制霉菌素A1、A3和多真菌素B，但比例因产地不同而有变化，A1的含量通常不超过12%，A3和多真菌素B的含量较高，浙江的产品在1992年时制霉菌素A3与多真菌素B之和已可稳定在70%以上。 二.抗生素与常规化药在理化性质上的差异（续）二.抗生素与常规化药在理化性质上的差异（续）2.稳定性不如化学药品好 分子结构复杂、薄弱环节多，易降解易转化，有效期超过3年的很少 3.分子量较大，有聚合现象 头孢类、β－内酰胺类三. 抗生素的特色检验三. 抗生素的特色检验因其具有生物活性 所以含量测定可以采用抗生素微生物检定法 无菌、微生物限度要采用薄膜过滤法 因抗生素各组分生物活性不同且易变异 所以要测定并各组分的比例 因其不稳定性 所以抗生素在检测过程中较少使用加热 水分测定采用卡氏测定或减压干燥 含量测定逐步淘汰专属性差的UV法和滴定法 三.抗生素的特色检验（续）三.抗生素的特色检验（续）因其过敏反应与高分子聚合物含量密切相关，所以有高分子聚合物检查 因为只有效价标准品无化学对照品 所以溶出度采用自身对照 溶液的澄清度与颜色 色差计法测定药品溶液的颜色 四. 抗生素含量测定方法的发展变化四. 抗生素含量测定方法的发展变化抗生素的含量测定方法是随着品种的扩展、仪器的发展而变化的 中国药典1985年版是转折点 在此之前， 品种：青霉素类、氯霉素类、红霉素类、 氨基 糖苷类、 四环素类居多 特点：多为发酵生产 多组分 方法：微生物效价检定法、手工滴定、 UV法 四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）在此之后，品种：头孢类、其他大环内酯类、 沙星类等迅速增加 特点： 合成或半合成 有占95%左 右的主组分 方法：HPLC法、电位滴定法出现 四. 抗生素含量测定方法的发展变化（续）四. 抗生素含量测定方法的发展变化（续）利福平的含量测定方法是随着仪器发展而变化的一个典型 效价法→UV法→TLC- UV法→HPLC法四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）现行版药典抗生素常用含量测定方法 青霉素类：电位滴定法和HPLC法 氯霉素类：UV法和微生物效价法 四环素类：HPLC法为主 氨基糖苷类：微生物效价法 头孢类： HPLC法 大环内酯类：微生物效价法 沙星类：滴定法和HPLC法四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）2005年版药典抗生素常用含量测定方法 青霉素类：HPLC法和电位滴定法 氯霉素类： HPLC法和微生物效价法 四环素类：HPLC法为主 氨基糖苷类：微生物效价法 头孢类： HPLC法 大环内酯类： HPLC法和微生物效价法 沙星类：HPLC法和滴定法四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）四.抗生素含量测定方法的发展变化（续）微生物效价法作为多组分抗生素最简便有效的测定方法一定会被保留 HPLC法作为高度专属性的方法势必被扩大使用 电位滴定法因其具有客观的终点判断而取代用指示剂判断终点的手工滴定法 因为大部分抗生素品种杂质含量较高、稳定性较差，所以专属性较差的UV法会被淘汰 五.抗生素的微生物检定法五.抗生素的微生物检定法抗生素微生物检定法的最基本原理 抗生素对微生物具有抑制或杀灭作用 当抗生素浓度达到一定量时（MIC）微生物就不能生长 在一定的抗生素浓度范围内抗生素的抑菌能力与抗生素的浓度呈现相关性 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）抗生素微生物检定法最常用的两种方法 1）杯碟法（管碟法） 杯：牛津杯（小钢管） 碟：培养皿 2）比浊法 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）比浊法：增订进2005版附录中 第一法 标准曲线法 第二法 2.2法或3.3法 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）在各试管中加入一定体积的液体培养基、试验菌和抗生素，按拉丁方或随机区组分配，置恒定温度条件下培养至适宜测量的浊度值（约4小时）后，在线检测或取出立即加入甲醛溶液（1→3）将微生物灭活，在530nm或580nm波长处测定培养液的透光率（比浊），用线性方程或按标准品和供试品的比值计算供试品中抗生素的含量 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）比浊法优点： 较杯碟法快速，较化学方法直接、直观 比浊法缺点： 影响因素较多，上述斜体下划线的地方掌握不好都会对实验结果产生不良影响 受条件和习惯的限制使用面不会很快扩大，但可以有一定进展五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）杯碟法（管碟法） 一剂量法（标准曲线法） 1963年版中国药典采用 二剂量法 1977年版以后中国药典一直采用 三剂量法 标准品标化时采用五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）二剂量法： 双碟的制备： 取直径约90mm、高16~17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基20ml，使其在碟底均匀摊布，放冷使凝固，作为底层；另取培养基置三角瓶中，加热融化后，将三角瓶置热水中，自然冷却至适宜温度，在酒精灯的火焰无菌范围内操作，加入检定菌悬液，摇匀，迅速分别在每付双碟的底层上面摊布均匀5ml，放冷使凝固，作为菌层；在每付双碟的菌层上面以等距离安放4个不锈钢小管，盖好陶瓦盖，备用。 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）检定法： 向上述制备好的双碟的不锈钢小管中滴加供试品溶液和标准品溶液，在规定温度培养适宜时间。取出，除去不锈钢小管，用抑菌圈测量仪测量各抑菌圈的面积。 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）操作： 铺底层 铺菌层 放钢管 加溶液 培养 测量五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续） 五. 抗生素的微生物检定法（续） 五. 抗生素的微生物检定法（续） 二剂量法的原理： 钢管中的抗生素溶液呈球形向外扩散，浓度逐渐降低，同时培养基中的检定菌也在生长，在抗生素浓度高于其最低抑菌浓度时，检定菌不能生长，当抗生素浓度低于其最低抑菌浓度时，检定菌又开始生长，于是就形成了透明的抑菌圈，抑菌圈的边缘处就是抗生素的最低抑菌浓度处。抑菌圈的大小代表了抗生素抑菌能力的大小。当标准品与供试品同为一种抗生素时其单位浓度的抑菌能力相同，则抑菌圈的大小就体现出了浓度的高低，抑菌圈的面积或直径与其浓度的对数呈线性相关。 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）二剂量法的影响因素： 标准品与供试品必须同质！这是实验的前提！ 环境：杂菌污染、抗生素污染（陶瓦盖、粉尘） 培养皿和实验台：水平度 培养基：营养水平、软硬度、透明度、酸碱度 溶液的制备：称量（防潮）与稀释（慎用超声） 检定菌：菌纯度、菌浓度 五.抗生素的微生物检定法（续）五.抗生素的微生物检定法（续）钢管：均匀度（重量、内径），洁净度，位置 点样：顺序、速度、一致性、保洁 培养：温度（先扩散后培养或反之）、时间 测量：人工、抑菌圈测量仪、碟子的取舍 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度自身对照溶出度测定法产生的背景 1995年版《中国药典》中有十几个抗生素制剂按经典的溶出度测定模式制订了溶出度检查项。但在经过一段时间的应用之后，渐渐暴露出一些问，如测定方法的准确度不好，回收率不符合要求，测定结果有时会超过标示量的120.0%等。六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）主要原因有两点： 生物测定标准品≠化学对照品 辅料干扰 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）自身对照溶出度测定法的特点 ①用供试品自身（平均片重量或胶囊内容物平均装量的供试品）制备对照溶液，而不是用对照品或标准品制备；这样既纠正了用标准品进行化学测定的不科学、不合理现象，又有效地解决了那些没有化学对照品的品种设立溶出度检查的困难。六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续） 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续） ②用供试品溶液中活性成分相当于自身对照溶液中活性成分的百分数来表示药物制剂的溶出度，而不用相当于标示量的百分数来表示，使得测定结果单一明确地体现制剂的崩解溶出性能，而不混杂含标量的水平在其中，可以使溶出度试验很好地配合制剂工艺处方的摸索筛选。六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）③该方法要求不同批号的供试品（即使是同一品种同时测定）每个批号分别制备对照溶液，这样对各厂家辅料差异较大同时辅料又对测定有干扰的品种也很适用，可较其他方法更便捷彻底地消除辅料干扰。 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）自身对照溶出度测定法的影响因素 该方法特殊和关键的地方主要在于自身对照溶液的制备，其中主成分是否达到了充分提取对测定结果的准确性起到了决定性的作用，而影响主成分充分提取的因素有以下几点应该考虑：取样方式、溶剂选择、助溶方式、辅料去除方式和稀释方式等。 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）取样方式：如何称取平均片重量或胶囊内容物平均装量的供试品来制备自身对照溶液，看似简单但也有学问。通常的做法是取片重差异或装量差异检查项下的供试品，研细，精密称取平均片重量或平均装量然后提取。但对于辅料比例远远大于主药比例或主、辅料比重差异较大的品种来说，在混合研细再称取一份量的过程中制剂的原始比例已经被改变。不过如果改取几片或几粒胶囊内容物，精密称定后在乳钵中研细，全量转移至一量瓶中制成浓溶液，再稀释成相当于一片或一粒的溶液，最后按平均片重或平均装量折算，则制剂主、辅料的原始比例就可以保持。 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）溶剂选择：自身对照溶液在制备时选用的有机溶剂或其他试剂应满足主成分溶解完全、快速、简便，无紫外吸收溶剂效应以及溶剂用量尽可能少的要求。特别需要留意的是，某些特殊的包裹制作工艺使得主成分的溶解度与原料药不完全一致，且由于自身对照溶液中包含有辅料，主成分的溶解与否不好观察，因此，除用计算的方法（溶解度的三倍以上）设计溶剂用量之外，还要依据回收试验数据最终确定溶剂用量。 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）助溶方式：超声或振荡是常用的助溶方式，超声因其简便快速曾经颇受广大实验人员的青睐。然而，由于超声功率较大，容易使液体温度升高，有些不稳定药物在溶解的同时就出现降解的现象也并不鲜见。因此，在没有充分的实验数据之前，超声不能滥用。经试验证明超声方式可用时，也应注明超声时间等 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）辅料去除方式和稀释方式：离心或过滤都可以有效去除辅料，但过滤用薄膜质量参差不齐，进口和国产薄膜滤过与吸附性能有时会相差很大，各药品受膜吸附的程度也不相同，因此处理不同，二者的辅料清除率和主药的损失率也会不同。稀释不同，溶剂背景吸收也会不同。所以，应尽量保持自身对照溶液与供试品溶液处理方式的一致性 六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）该方法是本版中国药典的独创，人们对此众说纷纭。其实，一种方法适用与否是相对的、有条件有范围的，抛开具体品种以及试验的目的绝对地争论一种方法的好坏是没有意义的，应该具体问题具体。自身对照法对于某些无对照品只有标准品的抗生素品种、辅料对测定有干扰的品种，以及摸索工艺处方时就是适用的。六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）六.自身对照法测定口服固体抗生素制剂的溶出度（续）对于含量测定和对照品标化不是采用生物检定法且辅料对测定无干扰的品种，通常采用的对照品法也有很多优点，如较为准确地体现药品的溶出量，用一项实验可连带地体现出药品含标量水平和崩解溶出两项指标的合格与否，对日常的药品检验来讲，事半功倍。因此，在2000年版药典抗生素品种中应用得有些过于广泛的自身对照法在2005年版中就有所改进。七.高分子聚合物检查七.高分子聚合物检查意义： 这项检查也是2000年版中国药典的新增项目之一，由于部分抗生素的过敏反应与这些高分子聚合物杂质的含量密切相关，因此，增设这项检查是非常必要和有意义的。 方法： 柱色谱法 用葡聚糖凝胶G-10（4~120μm）为填充剂，玻璃柱内径1.3~1.5cm，床体积50~60ml；流动相为各类缓冲液；UV检测器； 按外标法计算 七.高分子聚合物检查（续）七.高分子聚合物检查（续）缺点： 由于高分子聚合物对照品难以得到，其外标法测定用对照品是临时制备的表观聚合物，不是真正的对照品，且对照品和供试品需在不同的流动相系统中分别测定，这样对照品制备的重现性必然对结果的重现性有很大的影响。另外，复杂的人工操作也肯定会对实验带来较大的误差。 七.高分子聚合物检查（续）七.高分子聚合物检查（续）改进建议： 既然临时制备的对照品其分子量和结构式也是未知的，不如高分子聚合物的测定也仿照其他一些难以得到对照品的杂质的测定及限度规定一样，考虑使用主成分自身对照法，只要大家有一个统一固定的尺度，对于药品质量的控制还是行之有效的。 仪器完全可以改进 ，中压仪、高效液相色谱仪其实都可以使用，其他色谱柱也可以使用，操作就可简便、智能化了，同时可以改善分离效果，提高准确度。 null