基因组提取

生态环境 2007, 16(1): 47-49 http://www.jeesci.com Ecology and Environment E-mail: editor@jeesci.com 48 生态环境 第16卷第1期（2007年1月） 苏俊峰等：活性污泥总DNA不同提取方法的比较 49 活性污泥总DNA不同提取方法的比较 苏俊峰1，马 放1，侯 宁1，施 波1，赵立军1，王弘宇2 1. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090；2. 武汉大学市政工程系，湖北 武汉 430072 摘要：为了快速、简便和经济地获得活性污泥的总DNA，以用于分子生物学研究，采用5种不同的DNA提取方法提取活性污泥的总DNA，并通过提取的核酸总量、纯度、是否含有聚合酶链反应抑制剂等指标综合不同的提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.结果表明：蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取活性污泥总DNA效果最好，提取DNA总量多，纯度高，可不经纯化直接进行PCR扩增反应。 关键词：活性污泥；DNA提取；聚合酶链反应 中图分类号：X132 文献码：A 文章编号：1672-2175（2007）01-0047-03 活性污泥是活性污泥法污水生物处理技术的主体，而研究活性污泥中的微生物群落对于探讨废水处理的反应机理、工艺改进、优化控制都具有重要意义[1]。传统的微生物培养周期长，工作量大，且被分离培养的微生物种类只占自然界微生物总量的1%左右，故其应用受到了很大的限制。近十余年来日益成熟的分子生物学技术给活性污泥的研究带来了新的希望。借助分子生物学技术可以进行特异的微生物的检测和鉴定，分析微生物群落的组成、结构和种群演替状况，建立高效、可靠的微生物总DNA提取方法是进行微生物分子生态学研究的基础, 有关从土壤、水体、海洋沉积中提取DNA的方法已得到较好发展[2-3]，但对从活性污泥中提取DNA的方法研究较少。 DNA的提取根据破壁方法的不同可分为物理、化学和生物等多种破壁方法[4]，而不同的破壁方法裂解细胞，释放DNA的效率是不相同的，适宜的裂解方法是DNA提取成功与否的关键。由于活性污泥中除具有带有代谢活性的微生物群体外，还具有内源代谢、自身氧化的残留物；污水带入的难降解的有机物和无机物等物质，其中存在的腐殖物质等容易干扰DNA的检测, 这些污染可能抑制PCR中的Taq DNA聚合酶的活性，干扰限制性内切酶的消化，降低转化效率和DNA的杂交特异性等，因此高纯度的DNA对后续的工作有着重要影响。 本文比较了5种不同的DNA提取方法，以提取的核酸总量、纯度、是否含有PCR酶抑制剂等指标来评价不同细胞提取方法对活性污泥总DNA提取效果的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 试验用活性污泥取自吉林化工污水处理厂曝气池.用250 mL预先灭菌的三角瓶盛装,取样后立即保存于4 ℃环境中，并于48 h内抽提活性污泥样品的DNA。取回后立即测定主要特征，得到：pH=7.1，30 min污泥的沉降比SV%=30%，污泥质量浓度MLSS=3.2 g/L。 1.2 方法 1.2.1　样本总DNA的提取 取一定量的活性污泥液于10000 r/min下离心5 min, 沉淀以PBS缓冲液洗涤, 离心, 弃上清液,称取湿质量0.5 g的污泥于1.5 mL小离心管中, 500 μLPBS缓冲液重悬沉淀,采用以下5种方法提取污泥的总DNA。 （1）蛋白酶K-SDS-酚氯仿法:：向离心管中加入300 µLDNA提取液（100 mmol/LTris，100 mmol/LEDTA，200 mmol/LNaCl，1%PVP，2%CTAB，pH8.0）和20 µL蛋白酶K，涡旋振荡混匀后放于37 °C水浴锅中保温30 min，加80 µL的10%SDS，65 °C水浴1 h，12000 r/min离心样品10 min，将上清移至另一1.5 mL离心管中。用酚和氯仿纯化DNA，乙醇沉淀后用TE溶解DNA。 （2）柱提取DNA试剂盒法：用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行活性污泥总DNA提取。 （3）溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法：加300 µLExtraction buffer和20 µL溶菌酶（10 mg/mL），漩涡5 min，使样品充分悬浮。涡旋振荡混匀后放于37 °C水浴锅中保温30 min，加80 µL的10%SDS，65 °C水浴1 h，12000 r/min离心样品10 min，将上清移至另一1.5 mL离心管中。用氯仿异戊醇纯化DNA，乙醇沉淀后用TE溶解DNA。 （4）反复冻融法[5] （5）玻璃珠提取DNA试剂盒法：用Nucleic -Acid purification Kit进行活性污泥总DNA提取。 1.2.2　DNA浓度、纯度和产量的测定及电泳检测 用紫外吸收光谱法[6]测定产物DNA的浓度和纯度, 以λDNA（400 ng/μL）作为market，取2 μL提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（goldview0.06 μL/mL）。 1.2.3　PCR检查总DNA中的酶抑制剂　 以5种不同提取方法的污泥基因组DNA作为PCR反应的模板, 采用16 SrRNA基因V3区特异性的引物对F357和R518进行扩增反应。25 μL的PCR反应体系组成如下: 30 ng的模板、10 pmol每种引物、200 μmol/L dNTP、2.5 μL的10×PCR buffer (without MgCl2)、1.5 mmol/L的MgCl2、2.5U的Taq酶、用适量的双蒸水补足25 μL。PCR反应采用降落PCR策略[7], 即: 预变性条件为94 ℃ 5 min,前20个循环为94 ℃1 min, 65～55 ℃ 1 min和72 ℃ 3 min(其中每个循环后复性温度下降0.5 ℃), 后10个循环为94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min和72 ℃ 3 min, 最后在72 ℃下延伸7 min。PCR反应的产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 2 结果与讨论 2.1　不同DNA提取方法的裂解效率及纯化质量评价 5组总DNA的产率(每1 g污泥中的DNA量)和纯度(OD260/OD280)如表1所示,其中编号分别代表5种提取方法的2个平行样本。 表1　DNA产物的产率和纯度 Table 1　yield and purity of DNA products extracted from active sludge 提取方法 样品编号 产率 /(mg(g-1) 纯度(OD260/OD280) 蛋白酶K-SDS-酚氯仿法 1-1 0.873 1.70 1-2 0.752 1.62 柱提取DNA试剂盒法 2-1 0.805 1.72 2-2 0.671 1.68 溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法 3-1 0.524 1.52 3-2 0.466 1.46 反复冻融法 4-1 0.412 1.48 4-2 0.383 1.41 玻璃珠提取DNA试剂盒法 5-1 0.351 1.63 5-2 0.316 1.55 + 1 2 3 4 5 图1　5组总DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1　Fragment size distributions of the DNA products 由表1及图1可见, 蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取DNA的效果最好, 获得的DNA总量最多, 纯度也很高, 说明蛋白酶K-SDS可以使细菌细胞充分裂解释放出DNA，酚氯仿和吸附柱去除蛋白质，纯化DNA效果较好。而溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法和反复冻融法提取DNA产率较低, 纯度也不高。造成这种原因一方面可能是因为焦化废水中的污泥含有较多杂质，对溶菌酶的活性及DNA的纯化产生影响；另一方面可能是因为污泥是由很多种微生物构成的生物絮凝体，虽然提取过程中对其进行了充分的涡旋振荡，但并不能像液体培养基培养的菌体一样在溶液中充分悬浮，致使反复冻融不能使絮凝体内部的菌体完全释放出DNA。玻璃珠提取DNA试剂盒法获得的DNA总量最低, 但纯度较高。这可能是因为玻璃珠提取DNA方法更适于国外的机器自动化提取，而手工提取时裂解细胞效率较低，但这种方法回收的DNA纯度较高。 2.2　不同DNA提取方法的16SrDNA PCR扩增检查产物中的酶抑制剂 将不同提取方法获得的基因组总DNA进行PCR扩增，其扩增结果如图2所示。蛋白酶K-SDS-酚氯仿法、柱提取DNA试剂盒法、玻璃珠提取DNA试剂盒法获得了特异性PCR扩增产物，而溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法、反复冻融法未能扩增出特异性的条带，说明其中可能存在酶抑制剂。分析其原因可能是由于焦化废水中的活性污泥含有较多的杂质，而其中的某些成分能抑制酶的活性，溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法、反复冻融法获得的基因组DNA中可能含有这些酶抑制剂，导致Taq酶失活，扩增失败。采用柱基因组DNA纯化试剂盒将上述两种基因组DNA纯化后，将5种不同提取方法获得的基因组DNA进行PCR扩增均获得了特异性条带，说明经纯化可以去除酶抑制剂，成功地进行PCR扩增。溶菌酶-SDS-氯仿异戊醇法和反复冻融法提取的DNA含杂质较多，只有经纯化后才能进行PCR反应。 3 结论 5种不同DNA提取方法的结果表明，蛋白酶K-SDS-酚氯仿法和柱提取DNA试剂盒法提取活性污泥基因组DNA效果最好，不仅提取DNA的总量多，而且纯度高，不需纯化可直接进行PCR扩增。玻璃珠提取DNA试剂盒法获得的DNA量最少，但模板不经纯化可进行PCR扩增，说明玻璃珠法可以去除污泥中的某些酶抑制剂，使PCR反应得以顺利进行。提取的DNA量少可能是因为这种方法更适合于采用机器提取，而手工提取时某些操作条件没有优化造成的。 M 1 2 3 4 5 - 图2　5组总DNA样本的16SrDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 16sDNA PCR products from DNA samples M 1 2 3 4 5 - 图3 5组纯化后总DNA样本的产物16SrDNAPCR产物琼脂糖 凝胶电泳图 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis 16sDNA PCR products from DNA samples of purity 参考文献： [1] 郑雪松, 李道棠, 杨虹. 不同破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响[J]. 上海交通大学学报, 2004, 5: 815-818. 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The effects of total DNA extraction of different methods were discussed based on the yield ,purity of DNA and existence of PCR-inhibitor. The results showed that protein K-SDS-phenol/chloroform and UNIQ-10 DNA Extraction Kit methods could obtain the highest total DNA yield and DNA purity as well as PCR analysis in impurity. Key words: activated sludge; DNA extraction; polymerase chain reaction (PCR) 基金项目：国家973项目（2004CB185050） 作者简介：苏俊峰（1977－），男，博士研究生。E-mail: sjf1977518@sina.com.cn 通讯作者：马 放（19763－），男，教授，博士，博士生导师，主要研究方向为环境微生物学。E-mail: mafamg2002@263.net 收稿日期：2006-09-27