农杆菌瞬时转化法

农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下，花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1,22°C16h/8h(光/暗)70%湿度(扣透明白盒2周保湿)⑵将基质浇透水后，烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1,2粒种子,2-3天浇一次水。二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4leavesstage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株(年轻的、完全展开的4周大小)进行农杆菌侵染。转化前将浇透水,转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5mlLB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50mlLB+abtibiotics+Acetosyringon(final20|iM)含Rif(100mg/mL)、Str(100mg/mL)和Kan(50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌((GV3130))。检测菌液生长到指数后期0D600=0.6,4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存；4、重悬液(经常15ml)(10mMMES-KOH,pH5.6,10mMMgCl?100|1Macetosyringone乙酰丁香酮)重悬至0D600=l,(可以洗涤2次)5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为0D600=l6、根据实验，将以上三类农杆菌0.7：0.7：1体积混合，室温下静置3-4h,7、注射前烟草放在白色日光灯下1h,让气孔充分张开8、Agroinfiltration注射：重悬菌体，用1mL注射器(去针头)吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。(一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶)塑料薄膜覆盖，22C、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。标注：番茄bushystunt病毒P19蛋白抑制基因沉默BiFC注射时质粒OD600pSPYNE:pSPYCE:p19=0.5:0.5:0.5(三种菌终浓度)不用p19时单独一个质粒注射0D600=lpl9和单独的质粒如pCAMBIA1302时用重悬液调至每种菌液0D600=l等体积混合效率最好的可能是最顶部叶片烟草叶片表皮中没有叶绿素，叶肉细胞中有叶绿素100mL重悬液10mMMES-KOH,pH5.61MMES-KOH1mL10mMMgCl2,1MMgCl21mL100yM乙酰丁香酮1M乙酰丁香酮10yL重悬液每次现用现配(使用母液)1MMES-KOH母液21.325gMES溶于水，用KOH调至PH5.6，定容至100mL,高温高压灭菌20分钟，4°C保存1MMgCl2100ml1M乙酰丁香酮Acetosyringon(3',5'-dimethoxy-4'-hydroxyacetophenon(分子量196.20)0.196g乙酰丁香酮用1mlDMSO溶解，分成每管100ul,-20°C保存。