！大肠菌群测定

大肠菌群测定（GB/T 4789.03-2003） 大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。以100 mL(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）示。 培养基和试剂： 乳糖胆盐发酵管：【蛋白胨 20 g；猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5 g；乳糖 10 g；0.04%溴甲酚紫水溶液 25 mL；蒸馏水 1000 mL；pH 7.4】将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，，校正pH，加入指示剂，分装每管10 mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15分钟。 双料乳糖胆盐发酵管：参照乳糖胆盐发酵管，除蒸馏水外，其他成分加倍。 乳糖发酵管：【蛋白胨 20 g；乳糖 10 g；0.04%溴甲酚紫水溶液 25 mL；蒸馏水 1000 mL；pH 7.4】将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30、10或3 mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15分钟。 灭菌生理盐水：称取8.5 g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟。 革兰氏染色液：结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液 伊红美蓝琼脂平板：【蛋白胨 10 g；乳糖 10 g；磷酸氢二钾 2 g；琼脂 17g；2%伊红Y溶液 20 mL；0.65%美蓝溶液 10 mL；蒸馏水1000 mL；pH7.1】 将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15分钟备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂，冷至50~55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 操作步骤： 以无菌操作将25 mL待测样品放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶中(瓶内预置玻璃珠)，充分震摇成1:10匀液。 接种3只双料乳糖胆盐发酵管，接种量：10mL原液。 接种3只单料乳糖胆盐发酵管，接种量：1mL原液。 接种3只单料乳糖胆盐发酵管，接种量：1mL的1:10稀释液。 36±1℃培养24±2h。如果均无产气，为大肠菌群阴性。 如有产气，按下列程序进行： 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18~24h，然后取出，观察菌落形态，做革兰氏染色*和证实实验。 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 乳糖发酵管产气且革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即报告为大肠菌群阳性。 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。 * 革兰氏染色：①将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。②滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。③滴加95%乙醇脱色，约30s④水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。⑤□革兰氏阳性菌呈紫色，□革兰氏阴性菌呈红色。