中药复方总化学成分_浸膏_提取工艺研究

中药复方总化学成分(浸膏)提取研究 江平康1 ,刘群1,杨松沛2 ,卢亚艺2 ,唐帝2 ,朱子凤3 ,周李1 ( 1. 西南民族大学生命科学与技术学院, 四川成都 � 610041; 2. 四川省兽药监察所, 四川成都 � 610041; 3.西南民族大学校医院, 四川成都 � 610041) 摘要:本研究旨在提高白花蛇舌草、金银花、黄芪、甘草组成的中药复方的临床疗效和抗病毒作用机理研究,为复方剂型 改革和工业化生产提供科学依据。采用正交设计结合单因素考察, 对复方水提和醇沉工艺进行优化: 以水提后的浸膏重量为 考察指标,选用 L 9 ( 34 )正交设计试验, 对浸泡时间、用水量、煎煮时间、煎煮次数 4个因素进行优化;采用 H PLC 法测定复方 浸膏中的甘草酸含量作为醇沉优化指标,选用 L9 ( 34 )正交表设计试验, 对乙醇浓度、乙醇用量、醇沉时间 3 个因素进行优化。 结果得到复方水提最佳工艺:浸泡 1 h、12倍加水量、煎煮 4 次、煎煮时间 1. 5 h; 浸膏醇沉最佳工艺: 80%乙醇浓度、4 倍乙醇 量、醇沉 16 h。结合实际生产和成本因素,确定中药复方水提和醇沉工艺为:浸泡 0. 5 h、12 倍加水量、煎煮 3 次、煎煮时间1 h, 65%乙醇浓度、3 倍乙醇量、醇沉 16 h,水提浸膏收率为 57. 2% ,醇沉浸膏甘草酸含量为0. 42%, 均接近正交中的最高值。 关键词:中药复方; 正交设计;水提工艺; 醇沉工艺 中图分类号: T X461� � � � � 文献标识码: A � � � � � 文章编号: 1671�7236( 2011) 07�0242�04 � � 根据�祛邪可以扶正�和�扶正可以祛邪�的治疗 原则,以白花蛇舌草、金银花等清热解毒药为主药, 辅以黄芪、甘草等扶正药,组成具有抗病毒功效的中 药复方散剂,临床上用于鸡新城疫( N D)、鸡传染性 法氏囊病( IBD)、鸭病毒性肝炎( DH )、禽流感( AI) 等疾病的治疗, 并取得了良好的效果(段亮亮等, 2010;刘群等, 2010; Liu 等, 2010)。中药及复方有 效成分的含量一般较低, 临床散剂应用用量大、浪费 大、药材资源浪费。中药化学成分复杂,中药复方的 化学成分更为复杂,同一复方的化学成分与临床实 际运用的各种制剂所含有的化学成分, 存在有一定 的差异。制剂选择不当, 制备不得法,化学成分提取 工艺不优等不仅直接影响到临床疗效, 而且对中药 资源的保护、开发利用及规模化工业生产都造成不 利影响。 传统的优化设计方法有正交设计、均匀设计、单 因素设计。其中正交设计是一种多因素多水平的科 学试验安排方法, 具有均匀分散, 整齐可比, 计算简 便等优点,是现代中药研究最常用的设计方法(张素 萍等, 2008)。为了提高中药复方抗病毒作用, 探讨 中药复方抗病毒作用机理, 强调中药复方整体化学 成分产生效应及复方作用多层次、多环节、多靶点的 收稿日期: 2010�11�25 作者简介:江平康( 1986- ) ,男,四川人,硕士生,研究方向:现代 中兽药。 通信作者:刘群,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:中药(复 方)药理。 观点,本研究采用传统的正交设计法,结合单因素考 察,选用 L9 ( 34 )正交设计试验,以水提浸膏重量为考 察指标,对用水量、煎煮时间、煎煮次数、浸泡时间 4 个因素进行优化;以 HPLC法测定复方醇沉浸膏中甘 草酸含量为考察指标,对乙醇浓度、乙醇用量、醇沉时 间 3个因素进行优化,现将研究结果报告如下。 1 � 材料与方法 1. 1 � 材料 1. 1. 1 � 中药复方 � 白花蛇舌草、金银花、黄芪、甘草 等饮片购于海王星辰健康药房, 由四川省兽药监察 所鉴定,低温干燥避光保存。 1. 1. 2 � 仪器及试剂 � 电子天平( 00000249, 北京赛 多利 斯仪 器 有 限公 司 ) , JP�A 型 盘 架天 平 ( 00000052, 上海力能电子仪器公司) , 超声清洗器 ( KQ3200E,昆山市超声有限公司) , 高效液相色谱 仪( LC�10A TV) , 万用电炉( DL�1, 北京中兴伟业仪 器有限公司) ,纯水机( MILL�QA)等;乙醇、甲醇、乙 酸、醋酸铵( AR级,纯)均购自成都金山化学试 剂有限公司, 甘草酸铵标准品 (批号: 110731� 200615)由中国药品生物制品鉴定所提供。 1. 2 � 方法 1. 2. 1 � 水提 L 9 ( 34 )正交试验 � 选取正交试验设计 优化的方法,结合生产实际中的操作和成本问题及 该中药复方药的特性, 采用水提工艺,确定用水量、 浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数 4 个因素, 每个因素 选取 3个水平, 以 L 9 ( 34 )正交表设计试验, 以复方 水提浸膏重量为考察指标。影响因素及水平见表 �242� 经验交流 中国畜牧兽医 � 2011 年第 38 卷第 7 期 1。按比例称取该中药复方各单味药饮片共 320 g, 按照所设计的试验处理组合方法煎煮, 3层纱布过 滤,合并滤液并水浴浓缩。当浸膏温度在 80 � 时, 用密度计测量, 当比重值在 1. 18~ 1. 20时停止加热 浓缩,冷却至室温称重并计算出浸膏重量和收率。 表 1� 水提 L9 (34)正交试验因素水平表 水平 因素 A 浸泡时间 ( h) B加水量 (药材倍数) C加热时间 ( h) D煎煮次数 (次) 1 0. 5 8 1 2 2 1 10 1. 5 3 3 1. 5 12 2 4 1. 2. 2 � 醇沉 L 9 ( 34 )正交试验 � 以比重值在 1. 18~ 1. 20的中药复方水提浸膏进行醇沉试验,确定乙醇 浓度、乙醇用量、醇沉时间 3个因素,每个因素选取 3个水平,以 L 9 ( 34 )正交表设计试验, 以醇沉浸膏甘 草酸含量为考察指标。影响因素及水平见表 2。称 取经最佳水提工艺组合提取的水提浸膏 (比重值 1� 18~ 1. 20) 20 g, 加入一定浓度和一定量的乙醇, 4 � 冰箱放置,醇沉一定时间,按中华人民共和国兽 药典( 2005)以高效液相色谱法测定醇沉浸膏中甘草 酸的含量。液相条件: 十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂,甲醇- 0. 2 mol/ L 醋酸铵溶液- 冰醋酸( 67 � 33� 1)为流动相, 检测波长 250 nm, 柱温 30 � , 流 动相速度 0. 8 mL/ min,进样量 10 �L。 表 2� 醇沉 L9 (34)正交试验因素水平表 水平 因素 A 乙醇浓度 ( % ) B乙醇用量 (乙醇�浸膏) C醇沉时间 ( h) 1 65 2� 1 8 2 80 3� 1 12 3 95 4� 1 16 1. 2. 3 � 提取工艺可靠性和重复性检测 � 以已确定 的最佳水提和醇沉工艺, 平行制备 3分样品, 以醇沉 浸膏甘草酸的含量为标准检测提取工艺的可靠性和 重复性,并确定最佳提取工艺。 1. 2. 4 � 数据分析 � 试验数据用 DPS统计软件系统 分析,进行多重比较和方差分析。 2 � 结果与分析 2. 1 � 水提 L 9 ( 34 )正交试验结果 � 试验数据用 DPS 统计软件系统进行分析, 结果见表 3, 方差分析结果 见表 4, 多重比较结果见表 5。由表 3可知, 最佳提 取工艺组合应为A 2B3C2D3 , 即浸泡1 h,加 12倍水, 每次加热 1. 5 h, 提取 4次。方差分析(表 4)表明, 极差 D> B> A> C, 说明提取次数对浸膏收率影响 最大,其次为加水量和浸泡时间, 煎煮时间影响较 小; F 检验结果表明,提取次数对浸膏收率的影响显 著,浸泡时间、加水量和煎煮时间影响不显著。煎煮 次数多重比较分析(表 5)表明, 煎煮 3次和煎煮 4 次对浸膏收率影响差异不显著( P> 0. 05) ,但均显 著高于煎煮 2次的浸膏收率( P< 0. 05)。 表 3� 水提 L9 (34)正交试验结果数据 A浸泡时间 ( h) B加水量 (药材倍数) C加热时间 ( h) D 煎煮次数 (次) 浸膏重量 ( g) 1 0. 5 8 1 2 120 2 0. 5 10 1. 5 3 174 3 0. 5 12 2 4 187 4 1 8 1. 5 4 175 5 1 10 2 2 141 6 1 12 1 3 172 7 1. 5 8 2 3 153 8 1. 5 10 1 4 164 9 1. 5 12 1. 5 2 132 K1 481 448 456 393 K2 488 479 481 499 K3 449 491 481 526 k1 160 149 152 131 k2 163 160 160 166 k3 150 164 160 175 R 13 15 8 44 � � 注: K 表示总和, k表示平均数, R表示极差。下同。 表 4� 水提 L9 (34)正交试验结果方差分析 方差来源 方差平方和 自由度 均方 F 值 A 288. 2 2 144. 1 2. 1 B 328. 2 2 164. 1 2. 4 C 138. 9 2 69. 4 1. 0 D 3294. 9 2 1647. 4 23. 7 E (误差) 4050. 22 � � 注: F0. 05( 2, 2) = 19. 00, F 值 > F0. 05( 2, 2) 表示差异显著, F 值 < F0. 05( 2, 2) 表示差异不显著。下同。 表 5� 水提 L9 (34)正交试验煎煮次数多重比较 煎煮次数 浸膏重量平均值( g) 4 175. 3a 3 166. 3a 2 131b � � 注:同列数据肩标相同字母表示差异不显著( P > 0. 05) ,肩标不 同字母表示差异显著( P< 0. 05)。下同。 2. 2 � 醇沉 L 9 ( 34 )正交试验结果 � 试验数据用 DPS 统计软件系统进行分析。试验数据见表 6, 方差分 析结果见表 7, 多重比较结果见表 8。由表 6可知, 最佳提取工艺组合应为 A 2B3 C3 , 即用 80%乙醇浓 度,加 4倍剂量, 醇沉 16 h。方差分析(表 7)表明, �243�中国畜牧兽医 � 2011 年第 38 卷第 7 期 经验交流 极差为 A> C> B,说明乙醇浓度对甘草酸含量起主 要影响作用,其次是醇沉时间,乙醇用量影响最小; F 检验结果表明,乙醇浓度对甘草酸含量影响显著, 乙醇用量和醇沉时间影响均不显著。乙醇浓度多重 比较分析(表 8)表明, 65%、80%的乙醇浓度与 95% 的乙醇浓度存在有显著差异 ( P< 0. 05) , 但 65%、 80%的乙醇浓度对甘草酸含量的影响差异不显著 ( P> 0. 05)。 表 6 � 醇沉 L9 ( 34 )正交试验结果数据 A 乙醇浓度 ( % ) B乙醇用量 (乙醇�浸膏) C醇沉时间 ( h) 甘草酸含量 ( % ) 1 65 2 8 0. 3647 2 65 3 12 0. 3904 3 65 4 16 0. 4280 4 80 2 12 0. 3623 5 80 3 16 0. 4270 6 80 4 8 0. 4164 7 95 2 16 0. 2968 8 95 3 8 0. 2755 9 95 4 12 0. 2667 K1 1. 183 1. 024 1. 056 K2 1. 206 1. 093 1. 019 K3 0. 8390 1. 111 1. 152 K1 0. 3944 0. 3413 0. 3522 K2 0. 4019 0. 3643 0. 3398 K3 0. 2797 0. 3704 0. 3553 R 0. 1222 0. 0291 0. 0441 表 7� 醇沉 L9 (34)正交试验结果方差分析 方差来源 方差平方和 自由度 均方 F 值 A 0. 02815 2 0. 01408 71. 85 B 0. 001414 2 0. 0007071 3. 61 C 0. 001085 2 0. 001554 7. 93 E (误差) 0. 0003919 2 0. 0001959 表 8� 醇沉 L9 (34)正交试验乙醇浓度多重比较 乙醇浓度( % ) 甘草酸含量平均值( % ) 65 0. 39437a 80 0. 40190a 95 0. 27967b 2. 3 � 提取工艺可靠性和重复性检测结果 � 为检验 水提和醇沉最佳工艺(水提工艺组合 A 2B3C2D3 , 醇 沉工艺组合 A2 B3 C3 )的可靠性和重复性,按最佳工 艺平行制备 3分样品。结果显示, 320 g 复方药材所 得浸膏的平均重量为 183 g ( 180、184、185 g) , 水提 浸膏收率为 57. 2% ,醇沉浸膏甘草酸的含量平均为 0. 42% ( 0. 38%、0. 39%、0. 47%) ,均接近正交方案 中的最高值,甘草酸高效液相色谱图见图 1。考虑 浸泡时间和煎煮时间对试验结果的影响及工艺成本 等因素,故确定提取工艺: 水提工艺为浸泡 0. 5 h, 12倍加水量, 煎煮 3次,第 1次煎煮 1. 5 h,第 2和 第 3次煎煮 1 h;醇沉工艺为乙醇浓度65%, 3倍量, 醇沉 16 h。 图 1 � 甘草酸 HPLC图谱 � � 注: A ,甘草酸标准品; B,醇沉浸膏甘草酸。 3 � 讨论与小结 水提正交试验结果表明, 除煎煮次数的其它 3 个因素包括浸泡时间、煎煮时间和用水量对浸膏收 率影响不大。一方面由于 A 1 和 A 2 因素的影响几 乎相同,可以考虑把浸泡时间缩短至 0. 5 h;另一方 面由于 C1、C2 和 C3 对浸膏收率没有影响, 可以考 虑把煎煮时间确定为 1 h。从理论上讲煎煮次数越 多,浸膏量越大,但试验数据表明,尽管煎煮 4 次的 浸膏量要多一些,但多出的量与煎煮 3次差异不显 著( D3 和 D2 ) ,结合 D 2 远大于 D1 因素对浸膏量的 影响和工业化生产中追求成本最低化和效益最大 化,可以考虑把提取次数缩短为 3次。调整后的试 验结果均接近正交设计中的最大值, 说明调整后的 优化组合可行, 即浸泡 0. 5 h、12 倍加水量、煎煮 3 次、煎煮时间 1 h。 醇沉正交试验结果表明, 因素 A 1 和 A 2 对醇沉 浸膏甘草酸含量的影响差异不大, 方差分析也表明 A 1 和 A 2 影响因素不存在显著差异; 考虑 B2 和 B3 �244� 经验交流 中国畜牧兽医 � 2011 年第 38 卷第 7 期 因素也不存在显著差异, 结合工业化生产的成本和 效益,可选择 A 1 和 B2。调整后的试验结果接近正 交设计中的最大值, 说明调整后的优化组合可行, 即 65%乙醇浓度、3倍乙醇量、醇沉 16 h。 本研究的醇沉工艺优化指标选择醇沉浸膏甘草 酸含量的原因是: � 试验前选取了该中药复方的 4 味主药白花舌蛇草、黄芪、金银花、甘草进行了试验 前的液相预试验,结果表明甘草酸的液相出峰分离 度好于绿原酸和黄芪多糖。� 甘草酸是中药甘草最 主要的化学成分,本身具有抗病毒、抗肿瘤和增强机 体免疫功能等作用(苑可武, 2002) ,符合该中药复方 的临床应用特点。 按照中药配伍理论, 中药复方是中医药的精髓, 目前作用机理研究还局限于西药作用机理的研究模 式,忽略中医药理论, 尤其是复方,应着重于整体化 学成分对机体产生效应及复方作用的多层次、多环 节、多靶点的整体调节水平。本中药复方在临床上 主要以散剂应用于鸡病毒性疾病的治疗, 一方面由 于其用量大、浪费大、显效慢, 需改变药物剂型以达 到�三小、三效、五方便�的药物新剂型, 另一方面探 讨中药复方抗病毒作用机理, 尤其是体外细胞培养 法和半体内鸡胚法的研究,直接利用粉末制剂可造 成鸡胚死亡和细胞不能生长, 这就需要对其有效成 分、有效部位甚至整体化学成分进行分离提取。中药 及复方具有成分复杂,作用靶点多的特点,但缺乏现 代科学的量化指标,其�安全、有效、可控�缺乏性 和标准性,因此建立合理统一的试验方法和检测指 标,高效、快速、微量、准确的中草药化学成分提取分 离方法,规范评价方法和指标等就显得尤为重要。本 研究的意义就在于优化、规范中药复方总体化学成分 的提取工艺,为其抗病毒作用机理研究提供研究材料 和剂型改革及工业化生产提供科学依据。 参 考 文 献 1 � 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典(第 2部) [ M ] .北京: 中国农业出版社, 2005. 2 � 刘群,段亮亮,江平康.中药复方抗鸡新城疫病毒作用研究[ J] . 安 徽农业科学, 2010, 38( 20) : 10697~ 10699, 10724. 3 � 张素萍,胡能.中药提取生产工艺优化的实验设计[ J ] .贵州科技 工程职业学院学报, 2008, 3( 3) : 3~ 5. 4 � 苑可武.甘草酸的提取和精制法概述[ J] . 中国医药工业杂志, 2002, 33( 7) : 362~ 363. 5 � 段亮亮,刘群,江平康.中药复方在鸡胚水平上抗鸡新城疫病毒的 作用研究[ J] .中国畜牧兽医, 2010, 37( 4) : 192~ 194. 6 � Liu Q, Duan L L, J iang P K. An tiviral ef fect s of compound t radi� ti on al Chin ese m edicin e on New cast le dis ease virus. An imal H us� bandy and Feed Science( USA) , 2010, 2( 4) : 29~ 31. The Research of Total Chemical Composition ( Extractum ) Extracting Technology for Chinese Herbal Compound JIANG Ping�kang 1 , L IU Qun1 , YAN G Song�pei2 , LU Ya�yi2 , T ANG Di2 , ZHU Zi�feng 3 , ZHOU Li1 ( 1. Colleg e of L ife Science and T ecgnolo gy , Southw est Univ ersit y for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. Sichuan Institute of Veter ina ry D rug Contr ol, Chengdu 610041, China; 3. The Hospital of the Southw est Univ ersity for Nationalities, Chengdu 610041, China ) Abstract: The aim o f this paper is t o improve the clinical curative effect o f Chinese herbal com pound( Bai hua she she cao, Honey suckle, Astr agalus, Lico rice) and promote research o f antiv ir al mechanism o f action and provide t he scient ific basis for chinese herba l compound formulations r eform and industrialized product ion. This study adopt ed o rthogonal design w ith single facto r invest igat ion to optimize compound water extr action and alcoho l precipitation t echnolog y which were fo llow s: the w eight of wat er ext racting w as referr ed as index for checking and choosing L9 ( 34 ) o rthogonal table design test to optimize t he time o f so aking , water consum ption, decoction time, decocting number. The H PLC was used to measur e content of g ly cy rrhizic acid o f of chinese compound condensate which w as r eferr ed as index for optimizing . The L 9 ( 34 ) or thogona l table w as selected to opti� mize ethano l concent ration, ethano l dosage and the time o f alcoho l pr ecipitation. The best technolog y of w ater extr action w as soaking fo r 1 hour , adding 12 times alcoho l into Chinese medical mater ials, decocting 4 times and 1. 5 hour each. The best tech� nolog y o f the alcohol pr ecipitation w as to adding 4 times 80% alcoho l into ex tr actum and then sedimenting 16 hours. W ith the pr actical production and co st facto rs, t he techno lo gy of w ater ex tracting and a lcohol sedimentating of chinese herbal compound water ext racting and alcohol sedimentating w as made by the w ay of so aking one hour, adding 12 t imes alcoho l into chinese medi� cal materials, decocting 3 times and 1 hour each time, adding 3 t imes 65% alcohol into extr actum and t hen alcoho l sedimenting 16 hour s. The y ield of w ater ext raction ext ractum w as 57. 2% and the content of g ly cy rrhizic acid of extr actum w as 0. 42% which all clo se to the max imum result in t he r esults o f or thogonal design. Key words: Chinese herbal compound; o rthegonal design; w ater ex traction technolog y; alcoho l sedimentation technolog y �245�中国畜牧兽医 � 2011 年第 38 卷第 7 期 经验交流