高效液相色谱法测水溶性维生素综述

湖南饲料2007年第1期 高效液相色谱法测水溶性维生素综述 王海霞 （ 扬州大学动物科学与技术学院 江苏 扬州 225009） 摘 要：高效液相色谱是一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。本文综述了用高效液 相色谱法测定水溶性维生素含量的方法，列举了烟酸和维生素C的测定过程，对仪器的保养也作了部分 介绍。 关键词：高效液相色谱 水溶性维生素 烟酸 维生素C 高效液相色谱 (HighPerformanceLiquid Chromatography,HPLC)是近30年发展起来的一种 具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技 术。它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大 量的制备分离，灵活多样，其应用范围已超过其他 各种分离方法，尤其在生化医药样品的分析分离 方面更充分发挥它的特长，为推动该领域的进步 和发展作出了巨大贡献[1]。高效液相色谱系统是由 储液器、泵、进样器、分离柱、检测器、数据处理系 统等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打 入进样系统或进样器。样品通过进样器以精确的 体积插入流动相中,再被流动相带到柱内,分离过 程在柱内进行,被分离成单个组分的样品依次从 柱内流出,通过检测器样品浓度被转变成电信号 送到记录器和数据系统,经系统处理,数据以图谱 和图表形式打印出来[2，3]。对HPLC技术及设备原 理了解了,这样就能够提高仪器的利用率,更好地 发挥仪器作用[4，5，6]。 维生素为维持生物体正常机能的必需物质, 常作为营养强化食品的添加因子,它广泛存在于 谷类、果蔬、肉禽及蛋类等加工品中,因此,维生素 的检测对食品[7，8，9]、饮料[10，11]、制药[12]、饲料[13]等领域 都有非常重要的意义。 水溶性维生素与人体的生长发育及健康密切 相关。水溶性维生素中又以维生素C及B族维生 素较为重要[14]。水溶性维生素的测定方法主要包 括分光光度法、分子荧光法、微生物法和高效液相 色谱法等。分光光度法的样品前处理一般较复杂， 且干扰物质多，测定结果偏高；分子荧光法的样品 预处理也很复杂，在对多维片和维生素强化食品 进行多种维生素的检测时；会给定量带来一定的 困难；而用高效液相色谱法测定水溶性维生素，样 品前处理简单,样品用量少，分离速度快，可一次 性分析多种水溶性维生素。目前,国内用高效液相 色谱法分析水溶性维生素时，一般使用Water公 司专制的PICB离子对试剂，其价格昂贵且不易保 存[15]。目前，多种水溶性维生素的色谱分离条件有 离子对HPLC、胶束HPLC和非离子对HPLC[16，17，18]， 前者因离子对试剂价格昂贵，且对色谱柱柱效及 泵损害大，不适合作为常规分析方法[19]。 HPLC应用于水溶性维生素的分析,目前多为 纯方法研究或仅用于药物和一些基本样品的分 析。应用于食品,尤其是植物机体,同时测定多种水 溶性维生素的方法很少[20]。 1.复合预混合饲料中维生素B族的测定 目前复合预混料中都添加有多种维生素,因 为动物都具有潜伏的维生素不足症,这些潜伏的 维生素不足症不能观察出来,但在不利环境条件 下便可立即诱发并显示出缺乏症来。如果动物完 全缺少一种或数种维生素,或者是摄入量不足,某 些代谢过程就将受到损害,从而导致生长受阻或 者疾病。现就复合预混合饲料中维生素B1、B2、 检测分析 37 湖南饲料 2007年第1期检测分析 B6、B5(烟酸、烟酰胺)、B12(叶酸)的测定方法进行 探讨。根据GB14700-93饲料中维生素B1[21]的测 定方法、GB14701-93饲料中维生素B2[22，23]的测定 方法、GB14702-93饲料中维生素B6[24]的测定方 法,对B1、B2、B6进行测定。VB1、VB2、VB6是利用 荧光分光光度计,采用使维生素经提取后形成荧 光色素,在一定波长下所产生的荧光强度与试样 中维生素的含量成正比, 进行定量测定。 GB/T17813-1999饲料中烟酸、叶酸[25，26，27]的测定是 采用高效液相色谱法进行测定的，由于上述5种 B族维生素的前处理方法均各不相同，尤其荧光 法测定操作步骤繁琐,检测误差较大，在查阅国内 外文献的基础上，参考《 饲料添加剂分析（ 美国全 国饲料协会NFIA分析方法概要）》报导的方法对 试样提取条件、色谱测定条件及试样处理技术进 行了研究改进，建立了简便、快速的分析操作程序 不仅大大缩短了样品前处理时间，提高了工作效 率，而且其精密度和准确度结果与国标方法基本 相同[28]。 实验过程中应注意：(1)样品前处理加入 Na2CO3溶液后,溶液pH值必须呈明显碱性,如果样 品中含有酸性物质 (如抗坏血酸,氨基酸)需增加 Na2CO3的用量。由于一些维生素对光敏感,故需用 棕色玻璃容器;样品溶液中的叶酸不稳定,超过20h 峰面积就会下降约25%,故样品处理后需避光并尽 快检测；(2)离子对试剂的选择。采用HPLC分析复 合预混合饲料中5种B族维生素时,VB1、VB6[29]有 重峰现象,加入离子对试剂可改善峰形且使VB1、 VB6形成离子对而使各组分相应延长洗脱时间,达 到基线分离。在相同检测条件下,采用庚烷磺酸钠 和己烷磺酸钠进行对比试验,结果出峰顺序和峰面 积基本不变,只是保留时间有些改变。用己烷磺酸 钠更能缩短检验时间；(3)酸度。影响分离的主要因 素是流动相的pH值。乙酸调节流动相pH为3.0, 分离效果较好。流动相pH值降低有利于碱性溶质 与离子对试剂结合而缩短分离时间,但过低会降低 柱效,且叶酸在溶液中不稳定易析出,样品提取液 与流动相的酸度要保持一致；(4)选用反相C18柱 对分离复合B族维生素效果较好,前3个峰的时间 虽然接近,但都接近于基线分离,混合标准溶液中 各成分的峰面积与单独成分所得到的峰面积基本 一致,可以认为5个组分完好分离；基于水溶性维 生素在碱性介质中只有维生素B1(VB1)和维生 素B2(VB2)可以被K3Fe(CN)6直接氧化产生化学 发光的原理,建立了反相高效液相色谱(RP2HPLC) 分离柱后化学发光检测VB1和VB2的新方法,并 成功应用于复合维生素B片剂中VB1和VB2的 测定[30]。(5)V-B6是水溶性维生素,经典的测定方 法是荧光分析法,方法复杂,分析时间长,所用试剂 繁多,且氰化钾剧毒.用反相液相色谱定量测定的 方法,步骤简单,分析速度快[31]。 2.烟酸的测定 烟酸对奶牛的生产性能具有重要的作用[32]，包 括对生长、泌乳以及乳成分的影响，且烟酸对奶牛 特别是高产奶牛的营养作用的研究正处于方兴未 艾的阶段，但是目前研究试验结果不一，对羊的研 究也是如此[33]，因此，有必要对烟酸的营养作用进 行深入研究[34]。 烟酸是一种含氮杂环化合物，它可被具有烟 酸脱氢酶(nicotinicaciddehydrogenase)活性的微 生物转化生成6一轻基烟酸。6一轻基烟酸是一种 重要的农药、医药中间体。它可用于合成多种现代 农药，合成5,6一二氯烟酸(合成医药活性成分的 初始物质)等。6一轻基烟酸生物转化具有效率高、 专一性强、条件温和的特点。微生物转化生产6一 轻基烟酸已经成为国外研究热点，具有很好的开 发前景。开展这方面的工作必须首先建立合适的 检测6一轻基烟酸的方法。国外报道HPLC[35,36,37]法 4-61在检侧波长的选择、流动相的选择、适用性 等方面均存在不足。国内有试验对烟酸及6一轻 基烟酸的分析方法进行研究，建立了简便、快速、 准确的高效液相方法。 烟酸为B族维生素之一,临床上小剂量应用 于预防和治疗烟酸缺乏症,给药剂量为50～300mg/ 次,每日3～4/次；临床大剂量（ 每日1.5-6g）有降 血脂作用[38],但不良反应随之增加。制成缓释制 剂可充分发挥疗效，保证用药安全。国外已有烟酸 缓释制剂产品上市，本研究参考文献报道，建立人 血浆中烟酸浓度测定的反相离子对高效液相色谱 法（ reverse-phaseionseionpairHPLC,RPIC）[39,40]， 为其缓释片药代动力学研究及临床应用提供理论 和试验依据。由于烟酸的半衰期太短,只有45min, 38 湖南饲料2007年第1期 主要参考文献 1张书杰，李绍钰，林东康.畜牧生产中磷污染及治理 措施.河南畜牧兽医，2003，24(7)：10-11. 2刘艳琴，江富华.降低养禽业中磷污染的措施.家畜 生态，2001，22(1)：48-51. 3 Golovan，S.P，Wang，G，Zhang，J&ForsBerg，C.W.2000. CharacterizationandoverproductionoftheEscherichiacoli APPaencoded Bifunctionalenzymewhich exhibitsboth phytaseandacidphosphataseactivities.CanadianJournalof Microbiology.46：59-7l. 4 Golovan，S.P.，Hayes，M.A.，Phillips，J.P&ForsBerg，C. W.2001a.Transgenicmiceexpressingbacterialphytaseas amodelforphosphoruspollutioncontro1.NatureBiotech- nology.19：429～433. 5 Golovan，S.P.，R.G.Meidinger.，A.ajakaiye.，M.Cottrill.， M.Z.Wiederkehr.，D.Branry，C.Plante.，J.Plooard.，M.Z.Fan.，M. A.Hayes.，J.Laursen.，J.P.Hjorth.，R.R.Hacker.，J.P.Phillipsand C.W.ForsBerg.2001b.Pigsexpressingsalivaryphytasepro- ducelowphosphorusmanure. NaturalBiotechnology.19： 741-745. 6赵建军，许泽永，方小平.作物低植酸育种研究进展. 中国油料作物学报，2003，25(2)：94-98. 7陈洪深.养猪业粪尿处理技术及研究进展.湖北畜牧 兽医，1997，1：25-27. 其血药浓度极低,对于烟酸的血药浓度测定国内 均未见报道。为进行烟酸缓释片药动学与生物利 用度研究,需建立一种准确可靠的血药浓度测定 方法,可采用HPLC法测定血浆中烟酸的含量[41,42]。 国外分析方法中选择检测波长为210nml[43]或 230nml[44]，而采用最大吸收波长260nm，具有更高 的灵敏度，易于识别具有微量转化能力的菌种;国 外流动相采用磷酸盐缓冲液，采用水则避免了磷 酸盐易结晶堵塞管道的缺点;同时采用甲醇代替 了较贵的乙睛，符合经济的原则。国内有方法的分 析时间较国外方法要短。该方法是在国内广泛使 用的Agilent1100系列仪器上建立的，对于国内 开展烟酸转化工作、创制新农药具有较强的借鉴 意义。总之，该方法利于保护色谱仪器，利于对烟 酸及其转化产物6一轻基烟酸的快速定性定量测 定，适用于微生物转化工作中的批量样品测定[45]。 有文用ODS2C18色谱柱，0.01mol.L-1磷酸二 氢钠缓冲液和甲醇为流动相。由于烟酸极性大，在 反相柱上保留时间短，故在流动相中，加入离子对 试剂———溴化四丁铵，以延长烟酸的保留时间，使 之与血浆中的杂质及其代谢产物完全分离。烟酸 有很强的亲水性，故用丙酮进行萃取，再用氯仿进 行第2次萃取以去掉脂肪、蛋白等杂质。其作者曾 尝试过萃取1次，或改为其他有机溶剂萃取，效果 均不理想。近来文献报道[46，47，48]，烟酸用乙睛去蛋 白后，直接进样，无血样浓缩过程。本法与蛋白沉 淀法相比，提取效率高，杂质干扰少，提高了检测 的灵敏度，适用于烟酸缓释片[49]的临床药代动力 学研究。 3.测定Vc银翘片中Vc含量 通过对 Vc银翘片中 Vc含量测定方法的研 究,建立一种新型的HPLC测定方法，采用甲醇醋 酸铵(0.02mol/L)醋酸(体积比67∶33∶1)为流动相,甲 醇-醋酸钠(0.02mol/L)醋酸(体积比 70∶29∶1)的 混合溶液溶解样品,KrosmasilC18(4.6mm×250mm, 5μm)柱分离,249nm检测。该方法测定结果稳定, 重现性好,可操作性强,明显提高了Vc的回收率, 同时能将样品中的Vc及相关组分成功分离,有利 于准确测定Vc的含量。用HPLC测定方法可同时 直接测定 Vc银翘片中 Vc和对乙酰氨基酚的含 量,方法简便、快速、准确,可作为该制剂的含量控 制方法。因此,与滴定法相比,HPLC法测定Vc的 含量有很多优势[50]。 当然，我们还应注意高效液相色谱仪的正确 应用和科学保养[51]。严格按照说明书要求,进行规 范操作,这是前提。另外，定期清洗专用贮液瓶；珍 惜保护色谱柱,避免柱头突然产生大的波动,扰动 损伤柱床；采用保护(警戒)柱,延长柱寿命；避免超 负荷进样；做完试验,及时用适当溶剂冲洗柱子和 进样阀；色谱仪检测器输出与积分仪(处理机)要 匹配,尽量用流动相溶解样品,一是避免出现拖尾 峰、怪峰,二是避免试样在系统中由于溶解度降低 而析出。 参考文献（ 略） （ 上接第41页） 检测分析 39