督脉电针与神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的作用

468 中国康复医学杂志，2005年，第 2O卷，第 6期 Chinese Journal ofRehabilitation Medicine， Jun．2005， Vo1．20，No．6 · 综述 · 督脉电针与神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的作用 曾园山 李晓滨 郭家松 陈雅云 丁 英 陈玉玲 严重的外伤性脊髓损害主要表现为截瘫，目前还没有好 的治疗方法 ，由此给患者及其家属乃至社会造成沉重的负 担。 目前 ．这一伤病在我国的发生率呈逐年上升的趋势。因 此，探索出一种治疗急性脊髓损伤的有效方法 ，将有助于提 高患者的生存质量和减轻家庭和社会的经济负担。 脊髓损伤后．由于上行的传入神经纤维和下行的传出神 经纤维大量断裂 ，导致损伤平面以下的感觉和运动神经通路 被中断。因此，设法使受损伤的上、下行神经纤维再生 ，并穿 越损伤区长入另一端的脊髓组织中．重新建立突触联系：或 者通过移植神经组织或由移植的干细胞分化的神经元发出 的突起将两断端的神经纤维桥接起来 ，使受损伤的感觉和运 动神经通路被重建，直至一些重要的感觉和 自主运动功能得 以恢复 ，这是脊髓损伤后成功修复的关键所在。近二十年来， 有关脊髓损伤修复的基础和临床研究领域已取得显著进展． 形成许多促进脊髓损伤修复的治疗策略ll_ ，给脊髓损伤患者 带来一线曙光。本文就神经干细胞移植和督脉电针在脊髓损 伤修复中的应用基础研究作一概述。 l 神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的作用 在神经组织中除了神经元和神经胶质细胞两大类细胞 外 ，还存在一类具有 自我复制能力和分化潜能的细胞 ，称 为神经干细胞 neural stem cells)。它存在于发育期和成年期 动物以及人类特定部位的神经组织中，其主要功能是作为 机体一种后备细胞 。替换神经组织正常死亡的细胞或参与 神经组织损伤后的修复。神经干细胞在特定环境下可以分化 为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。现在可以利用神 经干细胞具有 自我复制能力和分化潜能的特性．将其移植治 疗脊髓创伤性疾病I“l。 1997年，Onifer等19[研究发现，将来 自胚胎大鼠缝际核的 永生化神经干细胞移植到不同模型的大鼠脊髓 内，其分化情 况显示出不同。在正常大鼠脊髓灰质中观察到神经干细胞长 出两个或两个以上突起；而在几种脊髓损伤的动物模型中f如 海仁酸损伤的脊髓灰质中、坐骨神经挫伤后的脊髓灰质中或 横断的脊髓灰质中)．神经干细胞仅长出两个突起。1999年 McDonald等”Ol报道 ，胚胎干细胞被移植到大鼠脊髓损伤处 后 ，胚胎干细胞可在体内至少存活 5周 ，可分化为神经元 、少 突胶质细胞和星形胶质细胞，并发现这种大鼠后肢能支撑体 重 ，步态协调功能得以部分恢复。2002年 Castellanos等⋯】在 脊髓损伤处移植具有神经营养素一3(neurotmphin一3．NT一31受 体(TrkC)基因修饰的神经干细胞 ．并同时给予外源性 NT一3 他们发现，高表达TrkC的神经干细胞在外源性 NT一3的作用 下能更好地在受损伤的脊髓内存活、迁移和分化为神经元 Wu等 将绿色荧光蛋白标记的神经干细胞注入大鼠第四脑 室 ，发现这些神经干细胞通过脑脊液来到脊髓损伤处并在其 中存活 8个月之久，有些已分化为少突胶质细胞 以及星形 胶质细胞。国内应用神经干细胞移植修复脊髓损伤的研究始 于本世纪初。2002年不同的学术期刊上报道神经干细胞移植 能够促进脊髓损伤结构和功能的修复【13-15[。 移植神经干细胞的目的之一是想替换因脊髓损伤而死亡 的神经元．重建神经通路 ．并在损伤部位的头端和尾端间起中 断作用。同时也希望可通过神经生长活性因子基因修饰使神 经干细胞表达外源性基因产物，然后将其移植到脊髓受损伤 的部位，使它们分泌大量的治疗性神经营养因子，以防止受损 伤的神经元死亡并促进上、下行神经纤维再生。这方面的研究 也取得较好的进展 “t”·㈣。我们研究组也观察到l】91，将 NT一3 基因修饰的雪旺细胞与神经干细胞联合移植到大鼠全横断脊 髓损伤处，移植的神经干细胞向神经元的分化率更高 ，促进 脊髓损伤结构与功能修复的效果更好。因此 ，神经干细胞移 植在脊髓损伤修复中具有较好的应用前景。 2 督脉电针在脊髓损伤修复中的作用 脊髓损伤导致的截瘫属于中国传统医学所谓的“休惰”、 “风痱”和“痿证”的范畴。中医认为，截瘫是由于督脉损伤所 致 ，从而使经脉不通 ，气血不达四末 。筋脉肌肉失于气血涵养 而致萎废不用。根据上述理论．中医针灸治疗脊髓损伤导致 的截瘫时，均首选督脉穴_删。而且临床实践。以督脉电针 为主治疗外伤性截瘫有较显著的疗效l21l。近十年来，在探讨督 脉电针促进脊髓损伤修复机制的实验动物研究中取得了一 些研究成果[22-23l。1995年余安胜等 应用督脉电针治疗大鼠 脊髓半横断损伤，发现督脉电针能够促使脊髓内受损伤的神 经纤维再生。我们研究组也尝试采用督脉电针治疗大鼠脊髓 全横断性损伤 ，用 Basso．Beattie，Bresnahan(BBB)评分法和 爬网格试验脊髓全横断性损伤及督脉电针治疗后大鼠 的运动功能，用荧光金逆行标记法检测再生神经纤维的神经 元，用生长相关蛋白一43(growth associated protein一43，GAP一 43)免疫组织化学法观察脊髓损伤区周围神经元 GAP-43的 表达。结果显示 ，应用督脉电针治疗后，大鼠后肢运动功能有 明显的恢复，损伤区脊髓组织溃变减轻 ，大脑体感运动区皮 质内锥体细胞层及中脑红核内的神经元密度增大 ，脊髓组织 十基金项目：国家自然科学基金(30270700和 30472132)：广东省中医 药管理局科研基金(101 139和303013) 1 中山大学中山医学院组织胚胎学教研室神经科学研究室，广州市 中山二路 74号，510080 2 通讯作者．课负责人 3 中山大学附属一院针灸科 4 广州医学院组织胚胎学教研室 作者简介：曾园山，男，医学博士，教授，博士生导师 收稿日期：2oo5一O2—16 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国康复医学杂志，2005年，第2O卷，第6期 Chinese Journal ofRehabilitation Medicine，Jun．2005，Vo1．20，No．6 469 内 GAP一43阳性神 经元增 多 ，在 脊髓横断 头侧端 灰质 内 、体 感运动区皮质内锥体细胞层及红核内有少量被标记的神经 元。结果表明，督脉电针治疗可减轻脊髓损伤后的继发性损 伤．促进脊髓内下行神经纤维再生和脊髓功能恢复。 3 督脉电针与神经干细胞移植联合治疗脊髓损伤 根据上述神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展以 及督脉电针治疗脊髓损伤的研究成果 ．我们提出将督脉电针 与神经干细胞移植联合应用作为治疗脊髓损伤的一种策略。 所采用的督脉电针一般是从脊髓损伤处上 、下 2个节段 的棘突的下方进针，达硬脊膜，然后在上、下 2针上分别接通 电疗仪的正负电极。从现代医学理论来看，这种方式的电刺 激可以直接作用于脊髓损伤处邻近节段所发出的脊神经后 支，甚至直达脊髓。Borgens等 用神经通路示踪技术显示，在 电刺激后脊髓损伤处有轴突长出小芽．而且有少量再生的轴 突穿越过致密的胶质疤痕。朱粹青等I 『报道，针刺可以促进备 用根模型鼠脊髓背角及背根神经节内GAp-43的表达。近年 来的研究表明，GAP一43与神经系统的发育 、突触形成、神经 元可塑性，以及轴突再生有密切关系。GAP一43的表达可促进 中枢神经元的轴突生长潜能_拍I。通过督脉电针刺激 ，我们推测 亦可能会增高脊髓损伤处邻近部位组织的cAMP水平 cAMP 是经典的胞内第二信使 ，通过激活蛋白激酶 、始动级联反应、 改变底物磷酸化状态而介导细胞功能。近年来的研究发现细 胞内高水平的 cAMP可协同某些神经营养因子 ，对中枢神经 元的存活及其轴突再生长起重要作用。神经营养因子对脊髓 运动神经元的促存活作用也需同时提高胞内cAMP水平才 能实现旧。最近研究还显示，电针可以促进受损伤的脊髓发生 神经纤维的侧支出芽，这与该脊髓组织内的 NT一3表达增加 有关俐。因此我们设想，利用督脉电针作用促使脊髓损伤处邻 近部位组织细胞合成和分泌多种神经生长活性物质 ，并通过 这些神经生长活性物质作用于移植的神经干细胞和宿主本 身的脊髓结构。一方面使神经干细胞更好地分化为神经元． 生长出轴突；另一方面促进全横断脊髓的上 、下行传导束神 经纤维再生 ，修复脊髓结构和功能。 我们的研究结果显示 ：联合应用督脉电针与神经干细胞 移植治疗的脊髓损伤大鼠，其后肢关节和肌肉活动、后肢攀 爬运动 、皮质运动诱发电位和皮质体感诱发电位的潜伏期和 峰峰值，以及后肢肌肉萎缩程度等指标都得到较明显的改 善 ，表明督脉电针治疗与神经干细胞移植之间有较好的协同 作用 。这为研究督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进 脊髓全横断大鼠后肢运动功能恢复的结构基础及其分子机 制提供行为学依据。为了了解联合应用督脉电针与神经干细 胞移植治疗 的脊髓损伤大鼠，其脊髓内下行或上行的神经纤 维再生以及大脑皮质和中脑红核受损伤神经元存活的情况 与该后肢运动功能得到改善的关系．我们继续观察到．在大 鼠脊髓全横断损伤处移植神经干细胞后应用督脉电针刺激 该动物的督脉阿是穴等一段时间．其脊髓横断处的去甲肾上 腺素能、5一羟色胺受体、降钙素基因相关肽能和 GAP-43 4 种阳性染色神经纤维发生明显的再生13o]。而且，去甲肾上腺素 能神经纤维穿越脊髓横断处到达尾侧端脊髓组织．这表明督 脉 电针与 神经干 细胞 移植联 合应 用能 促进 脊髓 横断 处 的去 甲肾上腺素能神经纤维再生。去甲肾上腺素能神经纤维是来 自于脑干下行到脊髓内的神经纤维，通过分泌去甲肾上腺素 调控脊髓神经元的活动。而含 5一羟色胺受体的神经纤维是脊 髓固有的神经元发出的，是受脑干神经元发出下行到脊髓 内 的 5一羟色胺能神经纤维分泌的 5一羟色胺作用。在脊髓内的 降钙素基因相关肽能神经纤维主要是背根节神经元发出进 入脊髓内的中枢支 ，与感觉信息的传递有关。 一般认为 ， 含有 GAP一43的神经纤维表明它们是处于活跃的再生长状 态I 。上述神经纤维的再生有赖于其神经元胞体的存活．这 是神经纤维再生的前提。脊髓损伤可致皮质脊髓束和红核脊 髓束损伤，往往引起大脑体感运动区皮质和中脑红核部分神 经元的死亡。为此，我们也检测到督脉电针与神经干细胞移 植联合应用能更好地保护大脑体感运动区皮质和中脑红核 内受损伤的神经元，而且有些存活的神经元发出的下行再生 神经纤维穿越脊髓横断处到达尾侧端脊髓组织 ．这提示督 脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠 受损伤的神经元存活及其轴突再生p0I。因此 ，这些结构上的变 化可能是督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全 横断大鼠后肢运动功能恢复的基础。现在还不清楚这些是否 通过督脉电针促进受损伤脊髓组织产生一些神经生长活性 物质 ，从而利于移植神经干细胞的存活和分化 ，以及引起受 损伤的脊髓结构和功能修复。我们进一步研究发现．联合应 用督脉电针与神经干细胞移植后受损伤的脊髓组织内cAMP 水平在损伤早期已出现显著升高，而且 NT一3、神经营养因子 受体一Trk和 GAP一43的含量也有增高的趋势I圳。这可作为理 解我们先前观察到督脉电针与神经干细胞移植联合应用能 够促进全横断损伤脊髓的结构和功能修复的一种可能分子 机制 4 小结 督脉电针可能通过促进受损伤脊髓组织细胞的代谢过 程 ，引起细胞膜的腺苷酸环化酶活性升高 ，使 ATP生成 cAMP增加，从而激活神经元和神经胶质细胞内蛋白激酶 A 的级联反应，在增强细胞代谢的同时，启动神经营养因子和 细胞生长因子等蛋白质的合成和分泌过程 ，从而促进脊髓 内 移植的神经干细胞存活和分化．以及促进受损伤神经元的存 活及其轴突再生，重建神经通路，恢复脊髓功能。 参考文献 [1】 Adams M，Cavanagh JF．International campaigI1 for cures of spinal cord injury paralysis (ICCP)：another step forward for spinal cord injury research[J]．Spinal Cord，2004，42(5)：273— 280． [2】 Dobkin BH，Havton LA．Basic advances and new avenues in therapy of spinal cord injury 【J]．Annu Rev Med，2004，55： 255— 282． [3】 吴立志，曾园山．促进损伤脊髓神经再生的研究进展【J]．解剖学 研究，2001，23(1)：57—61． [4】 Pfeifer K，Vroemen M，Blesch A，et a1．Adult neural progen— itor cells provide a permissive guiding substrate for corti— cospinal axon growth following spinal cord injury [J】_Eur J Neurosci．2004．20(7)：1695—1704． [5】 Setoguchi T，Nakashima K，Takizawa T，et a1．Treatment of spinal cord injury by transplantation of fetal neural precursor 维普资讯 http://www.cqvip.com 470 中国康复医学杂志，2005年，第 20卷，第6期 Chinese Journd ofRehabilitation Medicine，Jun．2005， Vo1．20，No．6 cells engineered to express BMP inhibitor[J1．Exp Neurol， 2004，l89(1)：33—44． 『616 Fujiwara Y，Tanaka N，Ishida O，et 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