脑蛋白水解物注射液

附件 3： 脑蛋白水解物注射液 Naodanbai Shuijiewu Zhusheye Cerebroprotein Hydrolysate Injection 本品为猪脑蛋白水解物溶液（供注射用）制成的灭菌水溶液，每 1ml 中含总氮（N）应 为 5.49～6.71mg，含总氨基酸（以氮计）应为总氮的 85％～100％，含肽（以氮计）应不低 于总氮的 20％。 【性状】 本品为浅黄色澄明液体。 【鉴别】 （1）取本品 2ml，加双缩脲试剂（取硫酸铜 0.75g 和酒石酸钾钠 3.0g，加 水 250ml 使溶解，在搅拌下加入 10%氢氧化钠溶液 150ml，加水至 500ml）4ml，应显紫红 色。 （2）在肽含量测定项下记录的游离氨基酸色谱图中，供试品溶液各氨基酸峰的保留时 间应与相应对照品峰的保留时间一致。 （3）精密称取脑蛋白水解物对照品适量，加水溶解并稀释制成每 1ml 中约含总氮 6mg 的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（中国药典 2010 年版二部附录 V D）测定。 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：柱长 250mm，内径 4mm，粒径 5μm）；以 0.1% 三氟醋酸溶液为流动相 A；以 0.085％三氟醋酸乙腈溶液－0.1%三氟醋酸溶液 （80：20） 为流动相 B，按下进行梯度洗脱；流速为每分钟 0.8ml；检测波长为 276nm。 时间（分钟） 流动相 A（%） 流动相 B（%） 0 100 0 40 50 50 45 0 100 53 0 100 55 100 0 65 100 0 精密量取本品与对照品溶液各 20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按中药色谱 指纹图谱相似度系统计算，供试品溶液的色谱图与对照品溶液色谱图的相似度（扣除色 氨酸峰后）不得低于 0.9。 【检查】 酸碱度 应为 6.9～7.5（中国药典 2010 年版二部附录Ⅵ H）。 溶液的澄清度与颜色 取本品 5 瓶，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 IX B 和 IX A 第一法），溶液应澄清无色；如显色，与黄色 6 号比色液比较，均不得更深。 蛋白质 取本品 5ml，加 20%磺基水杨酸溶液 2ml，混匀，溶液应澄清。 高分子杂质 照分子排阻色谱法（中国药典 2010 年版二部附录 V H）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用亲水高效体积排阻硅胶为填充剂（如：TSK GEL 2000SWxl，柱长 300mm，内径 7.8mm，粒径 5μm；或性能相当的色谱柱）；以三氟醋酸- 乙腈-水（0.05：40：60）为流动相，流速为每分钟 0.7ml；检测波长为 214nm。理论板数按 核糖核酸酶 A 峰计算不得低于 5000，各相邻峰之间的分离度按峰高与峰谷之比计算均不得 小于 3.0。 标准曲线的制备 取核糖核酸酶 A(分子量 13700)、胰岛素(分子量 5808)、胸腺肽 α1(分 子量 3108)、生长激素释放抑制因子(分子量 1638)各适量，分别用流动相溶解并定量制成每 1ml 中约含 1mg 的溶液作为分子量标准溶液。取上述标准溶液各 20μl，分别注入液相色谱 仪，记录色谱图，重复进样的保留时间相对偏差均不得大于 2.0%。以各峰的保留时间为横 坐标，分子量对数为纵坐标进行线性回归，相关系数不得小于 0.99。 测定法 取本品适量，加流动相稀释制成每 1ml 中约含总氮 1mg 的溶液，取 20μl 注入 液相色谱仪，记录色谱图。以面积归一化法计算，供试品溶液色谱图中分子量大于 5000 道 尔顿的高分子杂质的峰面积不得过 1.0%。 渗透压摩尔浓度 取本品，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 IX G），渗透压摩 尔浓度应为 300～600mOsmol/kg。 活力测定 取本品适量，加 10%小牛血清培养液制成每 1ml 中含氮量为 60µg 的溶液。 照活力测定法（见附）测定，修复率不得低于 100%。 异常毒性 取本品，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 XI C），按静脉注射法给 药，应符合规定。 过敏反应 取本品，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 XI K），应符合规定。 细菌内毒素 取本品，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 XI E），每 1ml 中含细 菌内毒素的量应小于 1.2EU。 降压物质 取本品，依法检查（中国药典 2010 年版二部附录 XI G），剂量按猫体重每 1kg 注射 2.0mg（按总氮计），应符合规定。 其他 应符合注射剂项下有关的各项规定（中国药典 2010 年版二部附录 I B）。 【含量测定】 总氮 取本品，加水稀释至适宜浓度，作为供试品溶液。精密量取适 量，依法测定（中国药典 2010 年版二部附录 VII D 第二法），每 1ml 中含总氮应为 5.49～ 6.71mg。 总氨基酸 取总氮测定项下供试品溶液，精密量取适量，置消化管中，加盐酸适量，充 氮封口，置 110℃水解 20 小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸发至干，加水使残留物 溶解并稀释至合适浓度，作为总氨基酸供试品溶液。用氨基酸分析仪或适宜的高效液相色谱 仪进行测定。另取相应的氨基酸对照品（见下表），精密称定并稀释制成合适浓度，作为对 照品溶液，同法测定。按外标法或以合适的氨基酸为内标以峰面积计算各氨基酸含量（以氮 计，色氨酸除外）。 氨基酸对照品 门冬氨酸(C4H7NO4) 甘氨酸(C2H5NO2) 缬氨酸(C5H11NO2) 苯丙氨酸(C9H11NO2) 谷氨酸(C5H9NO4) 苏氨酸(C4H9NO3) 甲 硫 氨 酸 (C5H11NO2S) 亮氨酸(C6H13NO2) 丝氨酸(C3H7NO3) 丙氨酸(C3H7NO2) 色氨酸(C11H12N2O2) 赖氨酸(C8H714N2O2) 组氨酸(C6H9N3O2) 精氨酸(C6H14N4O2) 异亮氨酸(C6H13NO2) 脯氨酸(C5H9NO2) 肽 取总氮测定项下供试品溶液，精密量取适量，加水稀释至合适浓度，作为游离氨基 酸供试品溶液，用氨基酸分析仪或适宜的高效液相色谱仪进行测定。另取总氨基酸项下对照 品溶液，同法测定。按外标法或以合适的氨基酸为内标以峰面积计算游离氨基酸含量（以氮 计，色氨酸除外），以总氨基酸减去游离氨基酸并计算其在总氮中的含量。 【类别】 同脑蛋白水解物溶液（供注射用）。 【规格】 以总氮计 （1）2ml:12mg （2）5ml:30mg （3）10ml:60mg （4）20ml： 120mg 【贮藏】 密闭，在凉暗处保存。 附： 活力测定法 本法系通过损伤 PC12 细胞后加入本品，采用 MTT 法测定细胞修复率作为活力测定指 标。 试剂 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3） 取氯化钠 8.0g、氯化钾 0.2g、无水磷酸氢二 钠 1.15g 及磷酸二氢钾 0.2g，加超纯水 1000ml 溶解后，湿热灭菌（中国药典 2010 年版二部 附录ⅩⅦ）。 10%小牛血清培养液 取 RPMI－1640 培养液 90ml，加已灭活的新生小牛血清 10ml。 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液 取胰蛋白酶 0.25g 及乙二胺四醋酸二钠 0.02g，加 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液 100ml 溶解后，用 5.6%碳酸氢钠溶液调节 pH 值至 7.2， 滤过除菌（滤膜孔径为 0.22μm），-20℃保存。 0.5mmol/L 过氧化氢溶液 取过氧化氢浓溶液 1.0ml 加水稀释至 100ml，再取 28.3µl 加 10%小牛血清培养液稀释至 5.0ml。 噻唑蓝（MTT）溶液 取 MTT50mg，加 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3）10ml 溶解 后，滤过除菌（滤膜孔径为 0.22μm），2～8℃保存，使用不超过两周。 测定法 用 10%小牛血清培养液培养 3～8 代的 PC12 细胞至对数增长期，用 0.25%胰 蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加 10%小牛血清培养液稀释至每 1ml 中含（0.8～1.2） ×10 5个细胞，将上述细胞混悬液在 96 孔细胞培养板上铺板，每孔 100µl，以 10%小牛血清 培养液 100µl 作为空白对照组，置 37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养 24 小时。供试 品组，每孔加供试品溶液 100µl，正常细胞组、损伤细胞组、空白对照组每孔分别加 10%小 牛血清培养液 100µl，每组设 3 个复孔。置 37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养 24 小 时。供试品组、损伤细胞组分别加入 0.5mmol/L 过氧化氢溶液 50µl，剩余孔加入 10%小牛 血清培养液 50µl，置 37℃，5%二氧化碳饱和水汽培养箱中培养 48 小时。结束培养前 4 小 时取出培养板，吸去培养液，每孔加入 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.3）洗一次，然后再 在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液（pH7.3）100µl 和 MTT 溶液 20µl，继续培养。培养结束后， 吸出培养液，每孔加入二甲基亚砜 100µl，摇匀，放置 5 分钟后，在酶标仪上以 550 nm 的 波长处分别测定其吸光度 A 值。 修复率％= Ag-As Az-As ×100% 式中 Ag 为供试品组平均吸光度－空白对照组平均吸光度； As 为损伤细胞组平均吸光度－空白对照组平均吸光度； Az 为正常细胞组平均吸光度－空白对照组平均吸光度。