抗疲劳实验方法

抗疲劳作用检验 　　1　负重游泳试验 　　1.1　原理 　　运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。 　　1.2　仪器 　　游泳箱(大小约50cm×50cm×40cm)，电子天平、铅皮。 　　1.3　实验方法 　　1.3.1　实验动物成年雄性小鼠，体重18－22g，推荐使用BALB/c小鼠。 　　1.3.2　剂量设置共设高、中、低、对照四个组，根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，扩大10倍作为其中一个剂量组，根据受试物的具体情况另设两个剂量组。经口给样。原则上连续给样30d，也可根据试验需要自行设定给样期限。 　　1.3.3　实验步骤 　　末次给予受试物30min后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深不少于30cm，水温25℃±0.5℃，鼠尾根部负荷5%体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间(min)。 　　1.4　数据处理及结果判定 　　游泳时间为计量资料，可以用方差。若受试物组游泳时间明显长于对照组游泳时间，且差异有显著性(p＜0.05)，可以判定该实验阳性。 　　1.5　 　　1.5.1　每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。 　　1.5.2　水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，以25℃为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果。 　　1.5.3　铅皮缠绕松紧应适宜。 　　1.5.4　观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。 　　1.5.5　不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试物组和对照组应采用同一批动物同时进行。 　　2　爬杆试验 　　2.1　原理 　　运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，爬杆时间的长短可以反应动物静用力时疲劳的程度。 　　2.2　 　　爬杆架。直径0.8－1cm、长约25cm的有机玻璃圆棒(经120目砂纸打磨)，上端固定于木板上，下端悬空，距地面约20cm。结构见示意图。 　　（图略） 　　2.3　实验方法 　　2.3.1　实验动物　雄性成年小鼠，体重18－22g。推荐使用BALB/C。 　　2.3.2　剂量设置　同1.3.2。 　　2.3.3　实验步骤 　　实验时，将爬杆架置于水温15℃、深约10cm的水盆中。末次给予受试物30min后开始实验，将小鼠放在有机玻璃棒上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃棒上跌落下来的时间，第三次落水时终止实验，累计三次的时间作为爬杆时间。 　　2.4　数据处理及结果判定 　　爬杆时间为计量资料，可以用方差分析。若受试物组爬杆时间明显长于对照组爬杆时间，且差异有显著性(p＜0.05)，可以判定该实验阳性。 　　2.5　注意事项 　　2.5.1　实验前小鼠经筛选，训练数次仍不肯爬杆者，废弃。 　　2.5.2　杆的质地和光滑程度明显影响小鼠的爬杆时间，要求杆的质地坚硬，光滑程度一致，以免小鼠爪子将杆表面刮损，影响光滑程度。 　　3　血清尿素氮测定　二乙酰—肟法 　　3.1　原理 　　样品中尿素在氯化高铁—磷酸溶液中与二乙酰—肟和硫氨脲共煮，形成一种红色的化合物，其颜色的深浅与尿素含量成正比，与同样处理的尿素标准管比较，可求出其含量。 　　3.2　仪器与试剂 　　721分光光度计，10mL带塞试管，1mL(或1.5mL)塑料离心管，电炉，锅，灌胃针头。 　　试剂盒；若无试剂盒，可自行配制试剂 　　1g/L二乙酰—肟溶液：取二乙酰—肟1.0g，氨基硫脲(thiosemicarbazide)0.2g，氯化钠4.5g，溶于蒸馏水并加至1000mL。 　　33g/L三氯化铁溶液：取三氯化铁1.0g溶于浓磷酸20mL中，加蒸馏水10mL，摇匀。 　　酸溶液：取蒸馏水800mL，慢慢加入浓硫酸50mL，边加边摇；再加入85%磷酸50mL，摇匀。加入33g/L三氯化铁溶液1.5mL，加水至1L。 　　10mmol/L尿素标准液(尿素氮28.01mg/dL)：精确称取尿素(AR)150.3mg溶于16mmo1/L苯甲酸溶液并加至250mL。 　　16mmol/L苯甲酸液：取苯甲酸2.0g溶于蒸馏水1000mL中，加浓硫酸0.8mL。 　　3.3　实验方法 　　3.3.1　实验动物　雄性成年小鼠或大鼠，小鼠体重18－22g，大鼠体重160－200g。推荐使用BALB/C小鼠，Wistar或SD大鼠， 　　3.3.2　剂量分组、给样途径及期限　大鼠以人体推荐量的5倍为基本剂量。其余同1.3.2。 　　3.3.3　实验步骤 　　3.3.3.1　末次给受试物30min后，在温度为30℃的水中游泳90min，采血测定。 　　3.3.3.2　样本准备　大鼠采尾血，小鼠拔眼球采血0.5mL。草酸盐、肝素或EDTA抗凝的血浆或血清。血清中的尿素在室温下可稳定24h，在4－6℃可稳定7d以上。 　　3.3.3.3　　操作步骤 　　3.3.3.3.1　试剂盒按照说明操作 　　3.3.3.3.2　自行配制试剂按下表操作 　　（表略） 　　 　　充分混匀，置沸水浴准确15min，立即用自来水冷却。用波长520nm，以空白管调零，读取各管吸光度(A值)。 　　3.3.4　尿素氮含量计算 　　 INCLUDEPICTURE "http://cnfoodtech.com/7.16/J370605552.jpg" \* MERGEFORMATINET 　　3.3.4.2　自配试剂　尿素(m mo1/L)＝Au×10/As 　　尿素氮(mg/dL)＝Au×28.01/As 　　式中Au－测定管吸光度 　　As－标准管吸光度 　　3.4.2　结果判定 　　统计方法可用方差分析。若受试物组高于对照组，且差异有显著性(p＜0.05)，可判定为该受试物有减少疲劳小鼠尿素氮产生的作用。 　　3.5　注意事项 　　3.5.1　为避免色度转移，应在标本加入后30min内读出吸光度值。 　　3.5.2　一般标本测定管反应后应澄清，严重脂血可制备血滤液重新测定。 　　3.5.3　煮沸时间应准确。 　　4　肝糖原测定　蒽酮法 　　4.1　原理 　　蒽酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。 　　4.2　仪器与试剂 　　4.2.1　仪器 　　721型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，沸水浴，灌胃针头，手术器械，玻璃漏斗，加样器，2mL、5mL、10mL吸量管，20mL带塞刻度试管，10mL带塞离心管。 　　4.2.2　试剂 　　5%三氯醋酸(用蒸馏水配)(TCA) 　　葡萄糖标准液 　　浓硫酸(AR) 　　蒽酮试剂：溶液中含0.05%的蒽酮，1%的硫脲，用72%的H2SO4配制。 　　①72%H2S04配制：烧杯中加入280mL蒸馏水，再加入高纯度的浓硫酸720mL(比重1.84)。 　　②蒽酮试剂配法：当H2SO4温度降至80－90℃时放入500mg纯的蒽酮，10g高纯度的硫脲，适当摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中，可保存两周。 　　4.3　实验方法 　　4.3.1　实验动物　同3.3.1。 　　4.3.2　剂量设置、给样途径及给样期限 　　大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量，其余同1.3.2。 　　4.3.3　实验步骤 　　4.3.3.1　样本制备 　　末次给样后30min，在温度为30℃的水箱中游泳90min，立即处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏200mg，加入4mLTCA，每管匀浆1min，将匀浆液倒入离心管，以3000转/min离心15min，将上清液转移至另一试管内。在沉淀中再加入4mL TCA，匀浆1min，再次离心15min，取上清液，并与第一次离心的上清液合并，充分混匀。 　　取1mL上清液放入10mL离心管中(每样品可做两平行管以保证获得可靠结果)，每管加入95%的乙醇4mL，充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜(也可选用将试管放在37－40℃水浴3h)。沉淀完全后，将试管于3000转/min离心15min。小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min。 　　用2mL蒸馏水溶解糖原，加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振荡管子直到完全溶解。 　　制作试剂空白和标准管： 　　试剂空白：吸2mL蒸馏水到干净离心管 　　标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液(含100mg/dL葡萄糖)和1.5mL蒸馏水放入同样的管子。 　　4.3.3.2　测定样品糖原含量 　　此时将10mL蒽酮试剂用力加入各管，液流(蒽酮试剂)直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入蒽酮试剂时起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴(水浴深度略高于管子液面)15min，然后移到冷水浴，冷却到室温。将管内液体移入比色管，在620nm波长，用试剂空白管调零后测定吸光度。并根据标准曲线计算出糖原含量，根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量(以mg/g肝表示)，并进行统计学处理。 　　4.3.3.3　糖原含量计算： 　　 　　DU：样品管吸光度 　　DS：标准管吸光度 　　0.5：为0.5mL葡萄糖标准液液中的葡萄糖含量。 　　0.9：为将葡萄糖换算成糖原的系数。 　　4.4　数据处理及结果判定 　　所得数据为计量资料，可用方差分析或t检验。若受试物组肝糖原含量明显高于对照组，且差异有显著性(P＜0.05)，可判定该受试物有促进糖原储备或减少糖原消耗的作用。 　　4.5　注意事项 　　4.5.1　测定的实验方法均为定量要求，因此所有取样加试剂均需准确。 　　4.5.2　糖原测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关，因此时间要控制准确。 　　4.5.3　蒽酮显色剂不稳定，以临用时配制为宜，注意避免采用绒布或被污染的糖类进入蒽酮反应。 　　5　乳酸测定 　　5.1　原理 　　在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长560nm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。 　　5.2　仪器与试剂 　　5.2.1　仪器　微量吸管，恒温水浴锅，电热水箱，分光光度计。 　　5.2.2　试剂 　　4%CuSO4 　　浓硫酸(AR) 　　1%NaF溶液 　　蛋白沉淀剂：按体积分别取一份10%的钨酸钠，一份1/3 mo1/L硫酸，再与28份蒸馏水混合即成 　　沉淀剂－NaF混合液：按体积分别取3份沉淀剂，1份1% NaF混合即成 　　1.5%对羟基联苯溶液：称取1.5g对羟基联苯溶于100mL热的0.5% NaOH中(可保存半年)乳酸标准储备液(1mg/mL)：称取106.6mg乳酸锂或171mg乳酸钙，以10%的三氯乙酸定容至100mL(室温下可保存半年) 　　乳酸标准应用液(0.01mg/mL)：准确吸取1.0mL乳酸标准储备液稀释定容至100mL，此液要求现用现配 　　5.3　实验方法 　　5.3.1　实验动物　同3.3.1。 　　5.3.2　剂量设置、给样途径与期限　大鼠以人体每日每公斤体重推荐量的5倍为基本剂量，其余同1.3.2。 　　5.3.3　实验步骤 　　5.3.3.1　游泳　末次给样30min后负重2%(体重)在温度25－30℃的水中游泳60min后停止，安静15min后采血备用，大鼠采尾血，小鼠拔眼球采血。 　　5.3.3.2　操作步骤 　　于5mL试管中加入0.48mL 1%NaF溶液，准确吸取全血20μ1加入试管底部。用试管上部清液清洗微量吸管数次，再加入1.5mL蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000r/min离心10min，取上清液，按下表操作。 　　（表略） 　　上述步骤完成后，摇匀，置30℃水浴30min(每隔10min振摇一次)。取出后放入沸水浴中加热90S，取出冷却至室温，在波长560nm处用5mm光径比色皿比色，空白管调零。 　　5.3.3.3　血乳酸含量计算 　　 　　5.4　数据处理及结果判定　该实验数据属剂量资料，可用方差分析。若受试物组血乳酸含量明显低于对照组，且差异有显著性(P＜0.05)，可判定为该项实验阳性。 PAGE 5