大脑缺血再灌注和线粒体功能障碍 2

大脑缺血再灌注和线粒体功能障碍 -------黄焕森主编，《神经外科麻醉与脑保护》 目前我们已经认识到，脑组织发生严重的缺血性损伤时，再灌注并不能使其损伤减轻或恢复，反而加重了损伤。大脑缺血再灌注时脑细胞的代谢发生一系列的病理生理变化，其产生损伤的机制复杂，归纳起来主要与氧自由基生成过多、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸的神经毒性作用以及基因达异常等因素有关。临床上大脑缺血再灌注在上述影响因素的相互作用下，最终主要表现为脑细胞水肿，甚至坏死以及凋亡。线粒体是能量代谢和自由基产生的主要场所，又是调节细胞内钙稳态的重要细胞器之一。近年来对线粒体超微结构的研究发现，细胞受到凋亡信号等不利因素的刺激后，线粒体会发生相应的结构和功能的变化，例如位于线粒体内外膜之间的线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的开放、线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP）的激活等。线粒体结构和功能的变化会进一步通过释放细胞色素C及其他凋亡相关因子启动caspase蛋白酶级联反应，干预着细胞的转归。深入了解及研究线粒体在脑缺血再灌注损伤的过程中所发挥的作用，通过各种途径保护线粒体的结构和功能，将有助于脑保护的实施。 一、线粒体的结构与功能 线粒体是真核生物细胞内普遍存在的一种重要细胞器，是细胞生成ATP的主要场所，是细胞内最主要的能量来源。人体内的绝大多数组织细胞都依赖于线粒体的氧化磷酸化作用获取维持自身代谢所需的能量。线粒体除了在氧化代谢将有机物氧化产生的能量转化为ATP以供其他代谢过程所利用外，在细胞信号转导、诱导细胞凋亡等方面也起着重要的作用。 1. 线粒体的基本结构与功能 线粒体具有外膜和内膜两层膜：外膜平滑、有弹性，厚约6nm，完整地包围着细胞器；内膜厚约6-8nm，位于外膜内侧，有许多向内折叠的皱褶，称为嵴。线粒体折叠的内膜可以增加其表面积，以增强其发挥功能的效率。内外膜之间有膜间空隙，内膜以内为线粒体的基质。基质是胶体，含有5%以上的蛋白质（酶），此外还含有DNA、RNA和核蛋白体等，具有一定的pH和渗透压。线粒体外膜、内膜、膜间空隙和基质均含有很多化学成分和功能各异的酶类，例如与生物氧化呼吸链密切相关的酶类、ATP合成酶、某些脱氢酶等都集中在线粒体的内膜上，而催化糖的有氧分解、脂肪酸氧化、氨基酸分解和蛋白质生物合成等有关的酶类则主要分布在基质中。 在线粒体基质内，三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH，NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化成NAD，与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。而在线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量使ADP和Pi合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。1分子NADH产生3个ATP分子。 2. 线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential，((m） 线粒体的外膜通透性很高，可让分子量小于10kd的小分子物质通过，而内膜对离子、小分子物质的通透性有严格的选择性，只有不带电荷的小分子才能通过，较大的分子和离子则需要特异的转载系统才能通过内膜进入基质。因此，由于线粒体内外膜通透性的差异而伴随电子不对称的分布，从而形成了线粒体膜内负外正的电位差，即线粒体跨膜电位（((m）。线粒体内膜的低通透性和电化学质子梯度是维持膜电位的基础。((m在维护着线粒体内外物质平衡，保持着线粒体功能正常方面发挥着重要的作用。((m 是线粒体合成ATP的动力，线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜电位势能合成ATP，一旦((m消散和/或电子传递受阻导致((m下降，可使细胞不能合成足够的ATP而无法完成正常的生命活动。越来越多的研究表明，在凋亡信号的刺激下，((m降低，这是凋亡级联反应过程中最先发生的重要事件之一。((m异常会导致氧化磷酸化脱耦联，氧自由基生成增多，ATP衰竭，线粒体基因转录和蛋白质合成紊乱，同时还可使线粒体膜的通透性发生变化，各种促凋亡因子由线粒体释放到细胞质中，激活半胱氨酸蛋白酶（caspase），从而导致细胞凋亡的发生。如果((m耗散，细胞就进入不可逆的凋亡过程，反之，如果能稳定((m，可以防止细胞凋亡。 3. 线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP） 在线粒体膜内外交界处，存在着一种蛋白性孔道，称之为线粒体膜渗透性转换孔（MPTP）。MPTP是跨线粒体内、外膜的一种电压门控性通道，由内外两层膜和基质多种蛋白质组成的蛋白质复合体，其主要组成部分包括：1.位于外膜的电压依赖性离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）和外周型苯二氮卓受体（peripherial benzodiapine receptor），2.位于内膜的腺苷酸转运蛋白（adenine nucleotide translocator，ANT），3.位于基质的亲环蛋白D（cyclophilin D），4.细胞质的己糖激酶（hexokinase-1），此外，膜间隙蛋白也参与了MPTP的组成。MPTP在上述组成部分的协同作用下，所构成的这一通道仅能让分子量小于1.5kd的物质通过。另外，抗凋亡蛋白家族成员Bcl-2与Bcl-xl直接与VDAC结合，抑制着VDAC的开放，从而形成正常的离子通道，促进线粒体基质中质子的外流，以及ATP/ADP在线粒体与细胞质之间的交换，维持着线粒体正常的生理功能。 MPTP在生理状态下呈间断开放并有可逆性，能通过分子量小于1.5kd的非特异性物质，并允许质子自由通过线粒体内膜，可使Ca2+从线粒体基质释放，从而维持胞质Ca2+的平衡，以及线粒体内电化学平衡状态，形成稳定的跨膜电位，也有利于线粒体跨膜电位所驱动的蛋白质输入线粒体基质，保持氧化还原通路通畅，推动线粒体ATP的合成。在不同的生理或病理生理状况下，MPTP的开放有两种模式，分别是低电导开放和高电导开放。低电导开放是可逆的，它使线粒体跨膜电位暂时性降低；高电导模式下MPTP开放则能使各种大分子物质通过线粒体内膜，进而导致基质显著膨胀。高电导模式下MPTP开放有两种状态：短暂和长时程状态，而MPTP长时程开放常常是不可逆的。 在不利条件下（如缺血缺氧、线粒体钙增多、自由基和游离脂肪酸大量生产、兴奋性氨基酸释放等）MPTP不可逆的长时程开放，导致内膜两侧离子梯度消失，使线粒体膜电位下降，甚至丧失，氧化磷酸化脱耦联和呼吸链断裂，ATP水解增加，能量合成障碍，导致细胞能量的丢失，最终可导致细胞死亡。与此同时，当细胞在凋亡信号刺激下，MPTP能将凋亡蛋白Bax集中到自身周围，形成更大的通道孔径，相对分子质量小于1500的物质通过线粒体内膜，使线粒体基质渗透压升高，导致基质高渗性，基质体积膨胀，从而使内膜肿胀甚至外膜破裂，并伴随着线粒体膜间隙的细胞色素C（cytochrome c，CytC）、细胞凋亡诱导因子（apoptosis induced factor，AIF）和Caspase蛋白酶原等促凋亡蛋白质的释放而引发凋亡的级联反应，导致细胞凋亡。 目前已有大量的研究显示，MPTP是神经保护的靶目标，抑制或阻断病理状态下MPTP不可逆的长时程开放，可能是脑保护重要环节。Sullivan等使用环孢素A与MPTP的重要组成部分亲环蛋白D（cyclophilin D）结合，干预MPTP结构的变化，结果显示，这有助于减轻创伤导致的皮质神经元损伤。 4. 线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP） 线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）是Inoue于1991年在大鼠肝线粒体内膜发现的ATP敏感性钾通道。mitoKATP也存在于不同细胞的线粒体内膜上，是一种可调节线粒体代谢活动的钾离子通道。线粒体的钾离子循环可直接影响线粒体基质容积的变化，当ATP高度生成时，线粒体跨膜电位下降，线粒体钾离子内流也随之下降，线粒体轻度去极化，此时，mitoKATP开放弥补了钾离子内流，避免线粒体轻度去极化引起的基质收缩。因此，在生理状态下，mitoKATP可以通过维持线粒体钾平衡，从而调控线粒体基质的容积，使线粒体容积变化与能量代谢变化相适应，并在线粒体氧化磷酸化产能过程中部分补偿质子泵产生的电荷转移，从而维持跨膜电位差和pH梯度，促进线粒体呼吸，增加ATP合成，减轻线粒体内钙超载。 近年来不少研究表明mitoKATP可能是各种脑保护预处理的一个触发器和/或效应器，是脑缺血/缺氧及药物等多种因素预适应的主要机制之一，在脑细胞的缺血保护中发挥重要作用。无论是体内还是体外实验均表明，mitoKATP均参与预处理对脑的保护作用，例如，二氮嗪（diazoxide）、克罗卡林（cromakalim）等mitoKATP开放剂可通过抑制线粒体通路和死亡受体通路降低神经元凋亡，保护缺血再灌注损伤后的脑组织，起到脑保护的作用。而且mitoKATP开放剂的这种保护作用大多数可被mitoKATP拮抗剂5-羟喹酸盐（5-HD）所逆转。Robin等采取缺血后处理的，研究其对大脑中动脉栓塞模型大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响，研究显示，在大脑中动脉缺血60min后持续24h再灌注前，给予3次30秒缺血/再灌注短暂的缺血后处理，结果减轻了脑梗死容积的40%和改善神经功能评分，结合mitoKATP开放剂二氮嗪后则减轻脑梗死容积60%，但二氮嗪的保护作用可被mitoKATP拮抗剂5-羟喹酸盐逆转。 mitoKATP开放与抗凋亡作用关系密切，其可能的机制包括：1.mitoKATP的开放将导致基质钾浓度升高，线粒体嵴肿胀，呼吸作用增强，达到最优化；2.mitoKATP的开放可降低线粒体膜电位，阻止线粒体通透性转换孔过度开放及凋亡蛋白酶的释放，同时减少线粒体Ca2+通道对Ca2+内流的驱动力，减轻钙超载；3.开放的mitoKATP可能改变线粒体活性氧的产生，从而激活蛋白激酶，进一步通过钙通道影响细胞凋亡；4.轻度脱耦联和钾通道开放剂引起的黄素蛋白氧化作用可以减少线粒体自由基的产生；5.线粒体膜电位的变化有助于缺血时糖酵解途径向有利于细胞存活的方向转变；6.减少谷氨酸的释放。 5. 细胞色素C（cytochrome c，CytC） 细胞色素是广泛分布于需氧生物细胞线粒体内膜的一类色素蛋白，其辅基为含铁卟啉衍生物。由于各种细胞色素的辅基结构、蛋白质结构及其连接方式均不相同，其最大吸收峰的波长和氧化还原电位也有差别，因此，细胞色素被分为若干种，目前从高等动物的线粒体内膜上至少分离出5中细胞色素，包括细胞色素a、a3、b、c、c1等。细胞色素a和a3现在还不能分开，可能两者结合在一起形成寡聚体，但a和a3各具有特征的吸收光谱，通常把a和a3合称为细胞色素氧化酶。在典型的线粒体呼吸链中，氢或电子的传递顺序是b→c1→c→aa3→O2。 细胞色素C位于线粒体内外膜间，是线粒体呼吸链复合物Ⅲ和Ⅳ之间的基本组成部分，在传递电子和生成ATP的过程中起着重要作用。细胞色素C除了参与电子传递外，在细胞凋亡的启动中，细胞色素C的释放被认为是线粒体凋亡途径的标志性事件，细胞色素C作为一个凋亡起始因子起着重要作用。然而，生理情况下，由于线粒体内膜对物质通透具有高度选择性，细胞色素C很难从内膜进入胞质。关于细胞色素C释放的机制，有研究认为凋亡蛋白Bax或Bak与线粒体外膜的电压依赖性离子通道（VDAC）结合后，线粒体通透性转换孔（MPTP）开放，细胞色素C从Bax/Bak和VDAC共同形成的大通道中释放；另外，MPTP持续开放导致线粒体肿胀，外膜破裂后，引起内外膜间的细胞色素C释放。 在受到损伤性刺激时（如缺血再灌注损伤），MPTP开放使细胞色素C从线粒体中释放入胞浆，释放到细胞质中的细胞色素C在ATP/dATP的参与下能与凋亡蛋白酶活化因子1（apoptosis protease activating factor 1，Apaf-1）结合形成寡聚体，Apaf-1通过其氨基端和Caspase-9前体的功能前区相互作用形成“凋亡小体”，凋亡小体内的Caspase-9前体可通过改变构象发生自身裂解，形成有活性的Caspase-9，继而激活Caspase-3，并进一步激活下游的Caspase。其中，Caspase-3是Caspase家族最重要的凋亡执行者之一，Caspase-3活化后可作用于胞浆中的细胞骨架蛋白，或作用于胞核中的DNA酶，使DNA断裂为89kd和28kd的片段，从而引起细胞凋亡。 6. 线粒体DNA（mtDNA） 线粒体DNA位于线粒体内膜基质中，靠近自由基产生的场所，无复杂的染色体结构，成簇裸露分散于基质中，无组蛋白保护；缺乏相关的DNA修复酶，因此，mtDNA容易受到缺血缺氧损伤，而发生突变、缺失。研究显示，大鼠局灶性脑缺血30min和90min后线粒体DNA含量均减少，缺血30min再灌注24h后线粒体DNA完全恢复，而缺血90min未恢复。研究结果已证明，脑缺血再灌注可引起线粒体DNA损伤，而缺血30min后线粒体DNA可恢复至未缺血水平，说明了线粒体DNA在短暂性脑缺血后修复的可能性。因此，缺血早期给予治疗纠正脑缺血可减少线粒体损伤以达到保护细胞的目的。 二、大脑缺血再灌注导致线粒体功能障碍的机制： 大脑缺血时，脑组织供氧缺乏，只能依靠糖酵解功能，线粒体呼吸链酶活性受到抑制，电子传递功能降低，进而ATP合成减少。当脑缺血再灌注后，氧自由基产生增多，急性大量产生的氧自由基可导致电子传递链酶活性进一步降低，形成恶性循环。大脑缺血再灌注后产生大量的自由基，可攻击富含不饱和脂肪酸的线粒体膜，破坏线粒体膜结构的完整性和功能。动物研究发现，脑缺血20min，线粒体主要磷脂含量即出现显著下降，再灌注1h，主要磷脂和膜流动性均降至最低。另外有研究也显示，大鼠单侧大脑中动脉局灶性缺血2h时，线粒体的大体结构已发生变化，主要表现为轻度肿胀；缺血再灌注4h时，线粒体肿胀更为明显，而且出现嵴断裂，溶解，甚至消失；缺血再灌注12h时，线粒体损伤严重，数量减少，出现胞质空泡化；缺血再灌注24h时，仅残存少量的线粒体尚可辨认。 大脑缺血再灌注导致线粒体损伤的机制复杂，Ca2+超载和自由基的损伤作用仍然是导致线粒体功能障碍的主要因素（如下图所示）。 1. 钙超载对破坏线粒体结构和功能的破坏 细胞外的Ca2+内流入细胞，主要集聚在线粒体内，线粒体具有完善的Ca2+摄取、释放系统，可以敏感而快速地感受Ca2+信号，并作出恰当的反应。Ca2+运转机制复杂，线粒体主要通过两条途径影响细胞内的钙离子的生成代谢与利用平衡：1.利用线粒体合成的ATP，通过钙依赖的ATP酶将Ca2+泵出细胞，或泵入细胞内的钙储存器——肌浆网（SR）和内质网（ER）；2.直接通过线粒体膜上的通道蛋白摄取Ca2+。线粒体对钙的摄取可以缓冲胞内Ca2+浓度，调节该信号传导，还可以做为胞内钙缓冲池，避免细胞内钙超载。但是，任何原因引起的钙离子浓度升高都可触发线粒体摄取Ca2+，导致线粒体积聚超量的Ca2+，对线粒体的结构和功能造成破坏。 大脑缺血再灌注时，细胞ATP含量迅速降低，神经细胞内外Ca2+浓度紊乱，大量Ca2+从细胞外转移到细胞内，细胞内钙超载使磷脂酶激活，磷脂分解，造成线粒体内膜结果受损，电子转移脱耦联，从而使线粒体氧化磷酸化作用减弱或者停止，产能代谢障碍，使ATP生产进一步减少、无氧代谢增强，加重酸中毒，加剧细胞损伤。与此同时，细胞质内过高的Ca2+浓度可刺激线粒体摄入Ca2+，导致线粒体内出现Ca2+超载。线粒体内过高的Ca2+则可促进线粒体膜上的通透性转换孔开放。线粒体膜通透性转换孔开放后，小分子物质进入线粒体内膜，使线粒体基质渗透压升高，基质体积膨胀，导致线粒体肿胀、破裂，并释放出细胞色素C、凋亡诱导因子和Caspase蛋白酶原等促凋亡蛋白进入细胞质，继而激活凋亡蛋白酶，从而促发细胞凋亡的级联反应。 2.自由基对线粒体的损害作用 大脑缺血缺氧时，氧分子缺乏，电子传递链酶氧化还原状态转变为还原状态，并引起还原当量的积聚。缺血再灌注期间，氧气再次进入组织，积聚的还原当量释放电子与O2结合生成O2-，O2-经超氧化物歧化酶（SOD）歧化生成H2O2。H2O2在铁离子螯合作用下发生Fenton反应[Fe2+＋H2O2→Fe3+＋OH·＋OH-]和Haber-Weise反应[O2-＋H2O2→O2＋OH·＋OH-]，从而生成活性更强的羟自由基（OH·）。 线粒体磷脂的多价不饱和脂肪酸链较多，对过氧化物更敏感，缺血再灌注期间产生的大量自由基和活性氧，攻击富含不饱和脂肪酸的线粒体膜，更容易破坏线粒体膜结构的完整性和功能。另外，线粒体DNA是裸露的，无组蛋白保护，故线粒体DNA较核DNA易受自由基攻击而损伤。线粒体DNA受损，使呼吸链复合物子传递完整性受到破坏，主要是呼吸链复合物活性受损，使黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性复合物途径被过度利用，自由基生成增加，超过了细胞本身的清除能力，导致细胞凋亡。 三、线粒体功能障碍对大脑的影响： 线粒体结构和功能损伤，继之而来能量代谢障碍，ATP含量下降使脑内蛋白质核酸合成障碍，影响神经元的功能。ATP含量下降还导致细胞膜上的Na-K-ATPase不能发挥正常功能，造成Na+-Cl-内流，带动H2O内流增加，细胞水肿。ATP含量下降以及缺血神经元持续去极化等因素可引起神经元内兴奋性氨基酸，如Glu等大量释放，导致兴奋性神经毒性，神经元死亡。研究证明，兴奋性氨基酸的神经毒性作用部分是通过损伤线粒体实现的。脑缺血时，NO激活NMDA受体，使Ca2+通道活化，细胞外Ca2+涌入细胞内，Ca2+又激活磷脂酶、蛋白酶、蛋白激酶、磷酸酶和NOS，使海马、皮质等部位产生过量的NO，大量的NO又激活NMDA受体，加重线粒体损伤。另外，线粒体能量代谢障碍就会产生乳酸，而ATP的缺乏会使乳酸转化途径如糖异生受阻，加之脑部糖异生能力相对薄弱，从而使乳酸堆积，造成酸中毒。 四、 综上所述，线粒体是一种结构和功能复杂而敏感的细胞器，脑缺血再灌注时，通过各种途径造成线粒体功能障碍，能量衰竭，从而进一步导致了细胞凋亡或死亡。因此，线粒体是脑缺血再灌注损伤的重要靶目标，研究线粒体在调节脑缺血损伤中的地位，通过多种机制保护线粒体的结果和功能，将有助于脑保护的实施。 图1，线粒体的基本结构 图2，线粒体通透性转换孔开放后的病理生理变化 图3，线粒体介导缺血再灌注损伤的机制 图1，线粒体的基本结构 图2，线粒体通透性转换孔开放后的病理生理变化 引自：Di Lisa F，Canton M，Carpi A，et al．Mitochondrial injury and protection in ischemic pre-and postconditioning．Antioxid Redox Signal，2011，14：881-891． 图3，线粒体介导缺血再灌注损伤的机制 引自：Di Lisa F，Canton M，Carpi A，et al．Mitochondrial injury and protection in ischemic pre-and postconditioning．Antioxid Redox Signal，2011，14：881-891．