脐带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存研究

创新交流 E-mail：zhyh@csta．org．en＼胡杨＼编辑＼第Ol期＼2009年＼中国科技成果 CHINASClENCEANDTECHNOLOGYACHIEVEMENTS 脐带血造血干细胞采集、 分离和冷冻保存研究 文／刘忠1孙自敏2吕蓉1李敏1郭晓睫1方勤1周学勇1刘会兰2丁利1杨红友3 (1合肥市中心血站，安徽合肥230031；2安徽省立医院，安徽合肥230001； 5加拿大多伦多脐血库Toponto，Canada) 擅 要：目的：优化脐带血造血干细胞采集、分离 和冷冻保存的方法，初步探讨建立脐带血遣血干细胞库 的系统方法。方法：运用抗凝、密闭式血袋无茵采集符 合要求的足月顺产或剖宫产新生儿脐带血，进行相应的 微生物项目及HLA分型检测，采用二次回浆再提取 的方法分离制备脐带血有核细胞(Nc)，并通过对不同 的降温速率优化脐带血遣血干细胞的冷冻保存及复温方 法，对复温后的脐带血造血干细胞进行计数及活性检测。 结果：共收集脐带血49份，筛选并冷冻保存了26份， 所收集的脐全血体积124．6±26．27删，NC总数(1．64士 0．94)×109；分离后脐血体积25．77士1．45ml，NC总数 (1．52-i-0．89)×109，回收率为(92．12土5．78)％。分 离前后细胞活性台盼蓝拒染率分别为(96．8士1．14)％ 和(95．7土1．63)％冻融前后Nc总数分别为(2．16士0．79) ×109和(1．97±0．95)×109，NC回收率(92．97土7．55)％， 台盼蓝拒染率分别为95．7％和96％，CD34+细胞数分别 为(8．02士4．61)X106和(6．89士4．15)×105，cD54+ 细胞回收率(85．56±5．27)％，粒单系细胞集落形成单 位(cFlH3M)回收率(91．45士5．44)‰脐血遣血干细胞 在冷冻保护剂和复苏方法相同而降温速率不同的情况下， 4"C～-40。C时采用l。c／嘲的降温速率优于5。c／r咖的降 温速率，一40。C～-90‘C时采用I'C／嘲或5"C／咖的降温 速率以及在置一196。C液氮保存前自-40。C降至-go。C或降 至一150。C之间，结果均无显著性差异。结论：优化的脐带 血遣血干细胞采集，分离和冷冻保存的方法，造血干细胞 回收率高，可以满足普通病人造血干细胞移植的需求。 关键词：脐带血；干细胞；低温保存 DOI：10．5772／J．issnl009--5659．2009．01．016 造血干／祖细胞移植(HSC／HPCT)已广泛用于 治疗多种恶性血液系统疾病。研究明，脐带血含有丰 富的造血干细胞及造血刺激因子，T淋巴细胞功能不健 全，对HLA相合要求不严格，正常情况下不含细菌、 病毒或肿瘤细胞，建立脐带血造血干细胞库已成为近年 来造血干细胞移植的最重大进展之一。本文通过优化脐 带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存的方法，初步探 讨建立脐带血造血干细胞库的系统方法。 一、材料与方法 1．脐带血采集 脐带血由安徽省立医院，合肥市妇幼保健医院等提 供。采用抗凝(ACD-B)、密闭式血袋在脐远端近胎盘 8～10cm处穿刺收集脐血，采集后室温保存，24h内分 离处理。各项检测标本取自留样管。 2．脐带血NC制备 (1)将采集的脐血试管留样lml并称重，计算脐血 万方数据万方数据 创新交流 中困科技成果＼2009年＼第Ol期＼编辑＼胡杨＼E-mail：zhyh@csta．org．cn CHINASCIENCEANDTECHNOLOGYACHIEVEMENTS 体积}以1：4(脐血为4)的比例向脐血中加入羟乙基淀 粉(HES)，充分混匀并静置5分钟后以509离心，离 心时间根据脐血的体积来确定，分出脐血的上层液体至 100毫升的转移袋内，脐血原袋保留待用；将转移袋以 4409、lOmin离心，上清液加回到原脐血袋内并混匀， 下层脐血干细胞留在转移袋内待用，将混匀后的脐血袋 以509离心，7离心时间比第一次离心时间少1min，离 心后的上层液体加入到转移袋内，和下层脐血干细胞混 合，将转移袋以4409、10min离心，分出上清液，留取 下层脐血干细胞悬液20毫升， (2)右旋糖苷和二甲基亚砜(DMSO)以1：1的比 例配制，置4℃预冷15minl将预冷后的保护剂用注射 器和静脉输液针缓慢加入到转移袋内并不断地混匀，使 DMSO终浓度为10‰将加好保护剂的脐血干细胞悬液 转入到冷冻袋中，体积约为25±5ml，试管留样Iml并 称重，计算出回收率。 3．脐血造血干细胞低温保存和复温 在4"C～-40℃、-40℃一-90℃降温过程中分别 使用两种不同的降温速率1℃／min、5℃／min和5℃ ／min、1℃／min进行冷冻保存效果比较，以及在放入 液氮前从-40℃分别降至一90℃和降至一130℃的效果 比较。 复温选择将冻存脐血自液氮罐液相移至气相，放置 5～lOmin取出，在37"(2恒温水浴箱内快速复温。 4．脐带血检测 ·4．1细菌检测 严格按国家标准对每一份脐血标本进行细 菌培养。对细菌培养阳性的标本，采用药敏试 验，有特异性抗菌素的标本分类保存，防止交 叉污染。对没有发现特异性抗菌素的标本不予 保存。 4．2传染性指标检测 胞率=活细胞总数／(活细胞总数+死细胞总数)× 100％l②CD34+细胞检测：使用流式细胞仪检测。采 用BectonDickinson公司产品。③CFU-GM的细胞培 养：采用商品化的MethocultTM培养基，随机选择5份 脐带血干细胞，37℃、5％C02饱和湿度培养14天，用 倒置显微镜计数40个细胞以上(冻融后8个以上)组成 的集落。 二．结果 1．脐带血采集 共采集49例，其中150ml以上的5例，100～150mi 的19例，60～100ml的20例，不足50ml的5例。平均 脐全血体积124．6±26．27IIll。 2．脐带血NC制备 采用二次回浆离心法，根据脐血的体积来确定离心 时间(图1)，提纯的脐血NC回收率为(92．12+5．78)％， 分离后的NC总数为(1．524-0．89)×109，见表l。 300 o250 二Ef200 誊150 鲁100 盗 50 O 101 1 1213141516171819 时间(min) 脐血体积与离心时间关系图 表1脐血样本的Nc回收结果(n=26) 分离前 分离后(蛆收牢％) I脐带I舡体积{lnl) 124．^±26．1725．77±1．45 NC计放f×Iln 1．64_-4-0．94I气'+n．Xqf02．1'4-气．781 严格按国家标准对每一份脐血标本进行ALT、 HBV、HCV、HIV、CMV和梅毒的初、复筛检测。阳 性结果不予保存。 4．5HLA分型 对脐血标本开展HLA—I，II类A，B、DR六个位 点采用PCR-SS0方法进行分型。 4．4遣血干细胞冻融前后数量及活性检测 (1)NC计数：采用血细胞计数仪和人工计数相结 合的方法。 (2)NC活性检测：①台盼蓝拒染率计数：活细 3．脐带血微生物项目检测 对49份脐带血细菌培养结果显示无细菌生长，初、 复筛结果均显示有4份标本ALT呈阳性，l份标本 HBV呈阳性，阳性标本弃用。 4．脐血造血干细胞低温保存 脐血造血干细胞在冷冻保护剂和复苏方法相同而 降温速率不同的情况下，提示从4℃～-40℃时采用 l℃／min的降温速率优于5℃／min的降温速率，NC 回收率和细胞活性检测经统计学比较有显著性差异 (P0．05)，见表2。 表2不同降温速率效果比较(n--16) 创新交流 ＼第Ol期＼2009年＼中国科技成果 CHINASClENCEANDTECHNOLOGYACHIEVEMENTS 自然沉降法、Fico]1分离法等，这些方法存在着耗时长、 降温适嘈嚏 NC叫收牢 台盼蝮拒染牢 P愤 1．1IL‘／n讧n 97．4+’30。91．1±3．50—n 4℃～-40℃ <0．05 5．0C／lllhtH4．74-'4q。H^’+5．30■ 1．0C／Jl正Il91．1±!．1o； 91．1±1．97。 一加℃～-90℃ >11．05 5．Ur，fntin0，14-1．铲。 90．34-’．R％ 采用从412开始以1℃／min的速率降至一40℃，然 后以512／min速率分别降至-9012和-130℃之后放 入一19612液氮进行比较，结果显示两者无显著性差别 (P>0．05)，见表3。 5．造血干细胞冻融前后数量及活性检测 表3程序冷冻仪降至不同温度效果bt较(n--．--16) 操作步骤繁琐、易染菌等缺陷，我们经过实验 研究采取了一系列改进方法，提高了脐血有核 细胞的回收率。(1)我们按1：4的比例向脐血 中加入HES使红细胞形成串状聚集，加速红 细胞沉降；分离脐血的分离袋我们选用了特制 的窄长型转移袋，这些措施有利于离心时的细 胞分层，提高了有核细胞的回收率。(2)脐血 的第一次离心条件我们改变以往不论脐血体积多少一概 使用固定的离心力和离心时间的方法，采用在固定离心 力的情况下，根据脐血体积的不同采用不同的时间进行 离心，取得了良好的分离效果。(3)为了提高脐血干 细胞的回收率，我们采用了二次回浆再提取的方法，把 降温范嘲 NC叫收率 f}盼蚯拒染牢 I'值 一40L‘～-90I、 01．1+1o。 91．1±1．9““ >0．05 一40(、～一l30℃ 92．3±1．9‰ 90．3+1．Xo。 表4 13份脐血冻融后细胞计数和台盼蓝拒染率结果(n=13) 冻触两 冻触J，j㈨1收串％) CD344-细胞总数(×l矿)牲．014-4．6l6．89±4．15(85．364-3．27) NC总教fx o}) 二．1(1±O．791．97±0．95(92．974-7．53) 台盼监姑染率(％) 95．7_-4-{．6396±1．5 表5粒单系细胞集落形成单位(CFU-GM)培养结果(n--5) 第一次离心后剩余的红细胞重新悬浮，再次离 心提取剩余的脐血干细胞，使整体回收率提高 5％～10％。(4)由于DMS0浓度高，渗透性强， 加注时会产生高热，我们采取了用右旋糖苷稀 释并预冷的方法，缓慢加注以减少DMSO对细 胞的破坏，提高复温后脐血干细胞的成活率。 (5)最终的浓缩脐血量我们控制在25±5ml， 较小的体积节省了液氮罐的储存空间，便于大 冷冻}lif 冷冻艟 体积(Inl)NCf×10”) 列收串(％) 袋落放 怂数(×to'’)袋落数 总教f×10^) 一 X 26。60 6．90 5．0IJ ，’^ ¨．IMJ 2．1J7 91．45 SD I．14 1．73 2．24 ('．85 I．87 11．79 5．44 使用流式细胞仪随机检测13份脐带血冻融前后 CD34+细胞总数分别为(8．02士4．61)X106、(6．89± 4．15)X106，回收率(85．36+3．27)％，NC回收率平 均92．97％，台盼蓝拒染率平均为96％，见表4，提示保 存条件和过程比较适合，对干细胞损失较小。由于保存 的标本数量有限，我们随机选择5份样本进行细胞集落 培养。结果见表5。 三．讨论 造血干细胞移植是迄今为止治疗各种恶性血液病、 艾滋病、先天性遗传性疾病等最有效的方法之一。由于 脐带血造血干细胞具有资源优势、独特的生物学特性和 移植适应症的广泛性，用脐带血代替骨髓及外周血进行 造血干细胞移植，已成为近10年来造血干细胞移植的最 重大进展之一。 目前，制备提纯脐血干细胞的方法有倒置离心法、 量保存脐血，节约了成本。我们用该方 法制备的脐血干细胞的有核细胞回收率 为(92．12土5．78)％，与美国纽约血液 中心脐血库、山东脐血库、上海脐血库 的水平相当，具有回收率高、操作简便、 节约成本等优点。分离出的有核细胞总数为(1．52±0．89) X109，按2X10，／kg的移植标准计算，我们分离保存的 脐血能够满足70公斤以下患者的移植需要。 有核细胞检测及活细胞计数是检验之前采集、分离 和冷冻工作是否有效的标准之一，只有有效细胞达到一 定数量，才能满足I临床移植使用。因此，在脐血浓缩之前、 浓缩后、冻融后每一阶段我们都及时留样检测相关指标， 以监控脐血干细胞的制备质量，为脐带血干细胞移植提 供保证。 在细菌检测方面，我们严格按国家标准对每一份脐 血标本进行细菌培养。对细菌培养阳性的标本，采用药 敏试验， 有特异性抗菌素的标本分类保存，防止交叉污 染。对没有发现特异性抗菌素的标本不予保存。 此外，我们还对保存的脐血采用PCR-SSO方法进 行了HLA基因型分型，提供配型资料。圆 ’ 万方数据万方数据 脐带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存研究 作者： 刘忠， 孙自敏， 吕蓉， 李敏， 郭晓睫， 方勤， 周学勇， 刘会兰， 丁利， 杨红友 作者单位： 刘忠,吕蓉,李敏,郭晓睫,方勤,周学勇,丁利(合肥市中心血站,安徽,合肥,230031)， 孙自敏 ,刘会兰(安徽省立医院,安徽,合肥,230001)， 杨红友(加拿大多伦多脐血库 ,Toronto,Canada) 刊名： 中国科技成果 英文刊名： CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY ACHIEVEMENTS 年，卷(期)： 2008(1) 本文读者也读过(7条) 1. 韩俊领.李茜.杨丛林.陆敏.韩忠朝.邱录贵.HAN Jun-ling.LI Qian.YANG Cong-lin.LU Min.HAN Zhong-chao. 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