麻痹性贝类毒物

AMAMFSAc17034 麻痹性贝类 毒物 生物 AM-AM-FS-Ac-17034 麻痹性贝类毒物 1.试剂 (a)麻痹性贝类毒物(S哈蚌毒素)的溶液——100μg/ml。从微生物学分文，食品和药物检验，可提供酸化的20%乙醇溶液。该标样冷藏可无限期稳定。 (b)麻痹性贝类毒物的工作标准溶液——1μg/ml。1ml标准溶液用水稀释至100ml，溶液在3—4℃可稳定数周。 (c)小白鼠——健康的小白鼠。19—21g重，用于常规试验的贮备群体，如小于19g或大于21g，应用校正因素(见17-3)以得到真实死亡时间。不用体重大于23g的小白鼠和使用过的小白鼠 。 2.试验过程 (注意:拿取可能含有麻痹性贝类毒物的材料时，需戴上橡皮手套。) 2.1.生物测定的准则 分别用10，15，20，25和30ml水稀释10ml 1μg/ml的标准溶液，各用1ml腹膜腔注射几只试验小鼠，得到5—7min的中位数死亡时间。稀释液的pH应为2—4，不能大于4.5。试用1ml水的差值进一步稀释。例如，如用25ml水稀释的10ml标准液能在5—7min内杀死鼠，则试验溶液稀释成10+24和10+26。 10只鼠为一注射组，每组用两份最好是3份中位数死亡时间在5—7min的稀释液，对每只小鼠腹膜腔注射1ml，测定死亡时间。即指从注射完成到小鼠呼吸停止经过的时间。 一或两天后重复试验，所用稀释液是如上述1ml水的增量相异的溶液。然后重复全部试验，从用最近配制的工作标准溶液配制试验稀释液开始。 计算:每10只小鼠一组用于每一种稀释液的中位数死亡时间。如果，任一种稀释液所注射的所有组的10只小鼠中位数死亡时间小于5min或大于7min，不管这种稀释液以后的结果。反之，如果某种稀释液注射的10只小鼠组中的任何一组得出了5—7min的死亡时间，计算时也应包括所有用组这一稀释值注射的10鼠组。即使有些组的中位数死亡时间小于5min或大于7min。对每种选出的稀释液，用于注射所有的10只鼠组，对照表17-3，从中位数死亡时间，测定小鼠的单位/毫升数。用小鼠的单位/ml数分别算出μg毒物/1ml，得出表示对1鼠单位等效的μg毒物的转换因子(CF值)，计算各CF的平均值。以此平均值为参比点，核对常规试验。如操作技巧欠妥或试验用鼠控制不严，单独的CF值在实验室内变化很大，这种情况将需要根据试验工作的完成量，继续用工作标准液或其稀释液进行试验。 2.2.贝类常规试验的使用标准 定期核对CF值。如下:如贝类产品的检验每周不足一次，在试验完成当天，用工作标准的适当稀释液注射五只小鼠，测定CF值。如一周内有几天都在检验，每周只需用标准稀释液核对一次。这样就使中位数死亡时间落在5—7min。如此测出的CF值应当用平均CF值核对误差应在±20%之内，如不在此范围，再加入5只小鼠到己注射的5只小鼠中，以完成一次10只小鼠组试验，用同样标准溶液的稀释液注射第二个10只小鼠组。测定第二组与第一组的平均CF值，取结果作为新的CF值。偏差大于20%表明，小鼠对毒素的反应或试验技术有明显改变，这种变化需要改变CF值。 重复核对CF值，通常结果都在±20%内，如较大的偏差频繁出现，可能在方法中存在未能控制或未被认识的可变因素，需在常规试验前进行研究。 2.3.样品的制备 (a)蚌、牡蛎和贻贝——用新鲜水洗净贝类通身外壳，切开闭壳肌，打开壳，用新鲜水冲洗内部，除去砂子或外来物，剥离闭壳肌和连在内壁上的组织，从壳里取出肉，开壳前，不用加热或麻醉剂，在这过程不要切坏或损伤软体动物体。收集约100—150g肉放在上釉碟里，尽快转移到No.10筛上，沥干水5min，挑出碎壳片，废弃沥出液。在家用绞肉机上，用3—6mm的孔绞碎或在捣碎机里捣混直至均匀。 (b)扇贝——分出食用部分 (闭壳肌)，仅取这部分试验，按 (a)，沥干水和研碎。 (c)贝类罐头——按17-1(b)，捣混制备。 2.4.萃取 称取100g混匀的样品于己称毛重的烧杯中，加100ml 0.1M HCl，搅拌均匀，检查pH(pH应小于4，最好约为3，如需要，按下述调pH)。加热混合物，缓缓煮沸5min，并冷至室温，调节冷却的混合物至pH2.0—4.0(绝不大于4.5)，用BDH广范围pH试纸、酚兰、刚果红试纸或pH计测定。对较低的pH则在搅拌下滴加5M HCl；升高pH，在恒定搅拌下滴加0.1M NaOH，以防止局部碱化及而引起的毒物破坏。转移混合物到量筒中并稀释到200ml。 混合物倒回烧杯，搅拌均匀，并使其沉淀，直至上层呈半透明状，并能倾析掉分离大到足以堵塞26号皮下注射针头的固体颗粒。如必要，以3000r/min离心混合物或上层液5min，或用滤纸过滤。仅需要足够进行生物试验的液体量。 2.5.小鼠试验 用1ml酸性萃取液对每只试验鼠做腹膜腔注射染毒，注意染毒时间，仔细观察作为小鼠死亡指示的呼吸停止时间，用秒表或钟的秒针记录死亡时间。先用一只小鼠做初始测定，若2—3只更好。如死亡时间或几只小鼠的中位数死亡时间小于5min，配制可能得到5—7min中中位数死亡时间的稀释液。若1或2只小鼠注射未稀释样品的死亡时间大于7min，则必须染毒≥3只小鼠以确定样品的毒力。如需大量稀释液，滴加稀HCl(0.1或0.01M)，调节pH到2.0—4.0(绝不大于4.5)，用5—7min死亡时间的稀释液接种三只小鼠。 2.6.毒力的计算 测定包括存活小鼠的中位数死亡时间，从下表查出与时间相符的小鼠单位数。如果试验动物重量小于19g或大于21g，对每只小鼠用Sommer's，表中该小鼠相应死亡时间的小鼠单位乘以该鼠重量校正系数；再测定组的平均鼠单位 (计算平均值，认为存活小鼠的死亡时间大于60min或相当于小于0.875小鼠单位)，乘以CF值将小鼠单位换算为μg毒物/ml。 μg毒物/100g肉=(μg/ml)×稀释倍数×200 就人类食用而言，认为大于80μg/g的值，有害，对人类是不安全的。 表 校正因素 死亡时间:小鼠单位与麻痹性贝类毒物(数)的关系 死亡时间a 小鼠单位 死亡时间a 小鼠单位 死亡时间a 小鼠单位 1:00 10 15 20 25 30 35a 40 45 50 55 2:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8:00 15 30 45 9:00 30 10:00 30 100 66.2 38.3 26.4 20.7 16.5 13.9 11.9 10.4 9.33 8.42 7.67 7.04 6.52 6.06 5.66 5.32 5.00 4.73 4.48 4.26 4.06 3.88 1.25 1.22 1.20 1.18 1.16 1.13 1.11 1.09 3:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4:00 05 10 15 20 25 30 35 40 45 11:00 30 12:00 13 14 15 16 17 18 19 20 3.70 3.57 3.43 3.31 3.19 3.08 2.98 2.88 2.79 2.71 2.63 2.56 2.50 2.44 2.38 2.32 2.26 2.21 2.16 2.12 2.08 2.04 1.075 1.06 1.05 1.03 1.015 1.000 0.99 0.98 0.972 0.965 0.96 50 55 5:00 05 10 15 20 30 40 45 50 6:00 15 30 45 7:00 15 30 45 21 22 23 24 25 30 40 60 2.00 1.96 1.92 1.89 1.86 1.83 1.80 1.74 1.69 1.67 1.64 1.60 1.54 1.48 1.43 1.39 1.35 1.31 1.28 0.954 0.948 0.942 0.937 0.934 0.917 0.898 0.875 小鼠重量校正表 小鼠重(g) 小鼠单位 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23 0.50 0.50 0.53 0.56 0.59 0.62 0.65 0.675 0.7 0.73 0.76 0.785 0.81 0.84 0.86 0.88 0.905 0.93 0.95 0.97 0.985 1.000 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 3.来源 AOAC 官方方法959.08（第17版）