玉米种子纯度检验标准

玉米种子纯度检验 ［ 作者：w1gju     来源：丹玉种业     点击数：779     更新时间：2007-7-20     文章录入：w1gju ］ 【字体： 】 中华人民共和国农业行业标准                             玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法  NY／T 449--2001                                         Identification purity of maize variety                                         using salting in protein eletrohporesis             1范围               本标准了玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度的室内检测方法。               本标准适用于玉米单交种及亲本的真实性和品种纯度鉴定。             2引用标准                            下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。               GB／T 3543.2－1995农作物种子检验规程扦样               GB／T 3543.5—1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定               GB 4404.1－1996粮食作物种子禾谷类             3定义               本标准采用下列定义。             3．1种子真实性               供检品种与文件（如标签等）是否相符。             3．2品种纯度               品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率示。             ［GB／T 3543．5］             3．3育种家种子               育种家育成的遗传性状稳定的品种或亲本种子的最初一批种子，用于进一步繁殖原种的种子。             4原理               从玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙烯酸胺凝胶的浓缩效应、分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用             下进行分离，通过染色显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组成的不同，种子内所含的蛋白质种类有差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子真实性和品种纯度进行鉴定。             5仪器设备及试剂             5．1仪器设备               电泳仪（500 V士5 V连续可调、0～400 mA连续可调、额定输出功率200 W）、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平（感量 0. 01g、0. 001g、0. 0001g各一台）、酸度计、磁力搅拌器、高速离心机（5 000 r／min以上）、电冰箱、电炉、离心管（ 1. 5   mL）、离心管架、移液管（ 10 mL、5mL、2 mL各两支）、微量进样器（ 5～IOO μL）、恒温箱、观片灯等。             5．2试剂                            丙烯酸胶、N，N’一亚甲基双丙烯酸胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R25O、无水乙醇、正丁醇等（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水）。             6溶液配制             6．1电极缓冲液               称取甘氨酸 6.00 g，倒入2 000 mL烧杯中，加入 1800 mL去离子水溶解，用 2.0 ml。乳酸调至pH3.3，再加去离子水定客至 2 000 mL，混匀。             6．2样品提取液               称取氯化钠 5.80 g，蔗糖200.00 g，甲基绿0.1515 g，倒人 I000 mL烧杯中，加去离子水800 ml。溶解，加热至微沸，放至室温，再用去离子水定容至 I000 mL。在 4℃条件下保存。             6.3分离胶缓冲液               取1.43 mL乳酸钠于 I000 mL烧杯中，加去离子水 980 mL，用乳酸调至pH3．0，再加去离子水定容至 IOOO mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。             6．4分离胶溶液               称取丙烯酸胺112.50g，N，N’一亚甲基双丙烯酷胺3.75g，抗坏血酸0. 25g，硫酸亚铁8.Omg，用分离胶缓冲液溶解，再用分离胶缓冲液定容至I000mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存（不超过 14天）。             6．5浓缩胶缓冲液               取O．3O mL乳酸钠于2OO mL烧杯中，加去离子水 90 mL，用乳酸调至pH5.2，再加去离子水定客至IOO mL，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。             6．6浓缩胶溶液               称取丙烯酸胺 6.00 g，N，N’一亚甲基双丙烯酸胺 1. OO g，抗坏血酸 O.03 g，硫酸亚铁0.8 mg，用浓缩胶缓冲液溶解，再用浓缩胶缓冲液定容至 IOO mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存（不超过 6天）。             6．7  3 ％的过氧化氢溶液               取3O％的过氧化氢 lmL，加 9 mL去离子水，贮于棕色瓶中，在 4℃条件下保存。             6．8染色液               称取考马斯亮蓝R25O 2． OO g，在研钵中用 IOO mL无水乙醇研磨溶解。过滤于棕色瓶中。取 IO mL该溶液，加入到 2OO ml，的 10％（W／V）三氯乙酸溶液中，混匀。             7电泳操作             7.1样品制备               按 GB／T 3543.2的要求，从送验样品中随机分取玉米种子至少 IOO粒，用单籽粒粉碎器粉碎，放入1.5mL离心管中，用滴管加入与样品体积相同的样品提取液，摇匀，放置 5 min后．再摇一次，3O min后，用离心机离心（5 000r／min）15 min，取上清液用于电泳。             7．2凝胶制备             7．2．1胶室制备               将预先洗净晾干的玻璃板装人胶条中，然后把胶条固定在垂直板电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧螺栓，备用。             7．2．2封底缝               根据电泳槽大小，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入适量3％的过氧化氢溶液（一般每5 mL分离胶溶液加 2O μL，3％过氧化氢溶液），迅速摇匀，并从长玻璃板外测活玻璃板倒入，振动电泳槽 3次，放平。            7.2.3灌分离            胶底缝封住后，用滤纸条插入两玻璃板之间，吸去团聚合而析出的水；量取分离胶溶液适量，加入3％过氧化氢溶液（～般每 15 mL分离胶溶液加 3％过氧化氢 20μL）迅速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之间，高度距短玻璃板上沿 1.2 cm；放平电泳槽并在试验台上振动 3次后，迅速加入适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后，吸出分离胶表面上的正丁醇，并用去离子水冲洗胶面3次，用滤纸吸干。             7．2．4灌浓缩胶               量取浓缩胶溶液适量，加入 3％过氧化氢溶液（一般每 5 mL浓缩胶溶液加 3％过氧化氢溶液40 μL），迅速搅匀，倒入两玻璃板之间，马上插好样品梳，样品梳底部距分离胶顶部O．5 cm。             7.2.5点样               浓缩胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液  15 μL，每点一粒后，都要用去离子水清洗进样器  3次。             7．2．6电泳                            加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽；接通电源，采用 SOO V稳压进行电泳，待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源。             7．2．7卸板               倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸人染色液中。             7．2．8染色               在 3OC恒温条件下染色 2～4 h。             7.2．9洗板               取出胶片，用O．5％的不加酶洗衣粉水洗净。             8结果计算             8.1电泳测定值计算               待整个供检样品电泳结束后，在观片灯上鉴定胶片上电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品粒数和非本品种粒数，并按式（1）计算电泳测定值足                                                供检样品粒数一非本品种粒数                                       X（％）＝－－－－－－－－－－－－－×100％   ……………（1）                                                       供检样品粒数             8．2样品纯度值计算               将电泳测定值X代入式（2）回归方程，计算出样品纯度值广，再将．与GB 44O4．l中的纯度值进行比较，判定样品是否合格。                                       Y＝52．9＋O．46lX               ……………………………（2）