人肾小管上皮细胞培养_操作指南

正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC）的培养方法 拆装与贮存 1. 检查所有容器是否漏液或破损。 2. 对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。或者，解冻并立即 培养。 3. 对于增殖细胞：用 70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养 箱（如不特殊说明，均为 37℃，5% CO2）中 3到 4个小时。细胞处于平衡状态后，除 去运送时的培养基并更新。 4. Bulletkit®使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中 4-8℃下冷藏保存基础培养基， -20℃下冷冻保存 SingleQuots®细胞生长因子。如送达后已经解冻，生长因子可在 4℃下 冷藏，并需要在 72 小时之内加入基础培养基中。加入基础培养基后，在一个月之内使 用，不要再次冷冻。 5. ReagentPackTM传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。传代试剂在运送过程 中可能会解冻。可以进行一次再冷冻。如果在 3 天之内使用，可以在 4℃下冷藏。 Trypsin/EDTA 溶液的保存时间有限并会在 4℃下活化。如果在送达之后出现解冻，立 即分装并在-20℃下冷冻。建议 HEPES 缓冲液（以下简称 HEPES）和 Trypsin 中和液 不要在 4℃下冷藏超过一个月。 注意： 为保持解冻后的 Trypsin/EDTA 的新鲜和活性，可将其按 20ml 分装并置于消毒的 离心管中，-20℃下再次冻存。 培养基的制备 1. 用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。 2. 用移液管将全部的添加剂加入培养基中。 3. 用培养基冲洗添加剂管瓶。对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。少量的残存， 即使 10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。 4. 将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。以此记录每种添加剂加入的时间 和含量。建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以 避免混淆和重复添加。 细胞解冻/起始培养 1. RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell，肾脏近球小管上皮细胞)的建议接种密 度为 2500 cells/cm2。 2. 根据接种密度和培养皿的面积确定培养皿的个数。在培养皿中加入适量的培养基 （0.2ml/cm2）并在培养前至少将培养皿放入培养箱中 30分钟。 3. 开启细胞冻存瓶前，先用乙醇或异丙醇消毒。在无菌区内，将瓶盖旋开约 1/4圈以释放 压力，然后再旋紧。在 37℃水浴中将细胞快速解冻，注意不要浸没整个冻存瓶。仔细注 意冻存瓶，当最后一片冰融化后将冻存瓶取出。解冻超过 2分钟会导致细胞功能无法达 到最佳状态。 4. 用移液管将冻存瓶中的细胞悬浮液分装至事先准备好的培养皿中。轻轻摇动培养皿使细 胞均匀分布，放回培养箱。 5. 不要用离心分离法移取冻存液中的细胞。该方法比培养皿中残存 DMSO 对细胞造成的 损伤更大。 传代 下述操作程序均针对 25cm2的培养皿。对于其它大小的培养皿需相应改变试剂用量。 第一份培养皿的传代准备： 1. 当细胞达到 70-90%融合并呈现许多有丝分裂象的时候，即可进行传代。 2. 对于每 25cm2要进行传代的细胞： a. 解冻 2ml Trypsin/EDTA至室温。 b. 取 7-10ml的 HEPES并达室温。 c. 取 4ml Trypsin中和液（TNS）并达室温。 d. 取出培养基并达室温。 3. 准备新的细胞传代培养皿。 4. 一次进行一份培养皿的传代。接下来所有的培养皿将按照第一份的最优化条件进行传代 （细胞数，细胞成活率，接种密度）。 在无菌区内： 1. 从培养皿中抽去培养基。 2. 用 5ml HEPES冲洗细胞。不要遗漏该步骤。培养基中含有中和 trypsin的多种蛋白质及 钙离子。 3. 从培养皿中抽去HEPES。 4. 向培养皿中加入 2ml的 Trypsin/EDTA。 5. 在显微镜下观察细胞层。 6. 将加入 Trypsin 的培养皿置入培养箱（胰蛋白酶消化）直到约 90%的细胞驱集。整个过 程依不同细胞种类约需要 2-6分钟。 7. 将培养皿在掌心轻敲使多数细胞脱壁。如果仅有少数细胞脱壁，可能是消化的时间太短。 30秒后再次轻敲。如果细胞仍然不脱壁，稍候并每 30秒轻敲一次。 8. 细胞脱壁后，用 4ml Trypsin中和液中和培养皿内的 trypsin。如果多数细胞在 7分钟内 未脱壁，原因是 trypsin的温度不够或活性太低致使细胞无法脱壁。按照前述的过程，向 培养皿中加入新鲜的温 Trypsin/EDTA 进行再次消化，或者向培养皿中加入新鲜的温培 养基，放回培养箱中直到准备好新鲜的胰蛋白酶消化试剂。 9. 迅速将脱壁的细胞移至 15ml的消毒离心管。 10. 用 2ml HEPES冲洗培养皿收集残留的细胞，然后加入到离心管中。 11. 用显微镜观察细胞采集后的培养皿，观察残留的细胞数量。残留量应少于 5%。 12. 将采集的细胞在 220 x g离心 5分钟。使细胞粒化。 a. 抽去大部分上层清液， 剩余 100-200μl。 b. 用指尖快速轻敲管底使粒化细胞松弛。 13. 用 2-3ml 培养基稀释细胞，并记录稀释细胞悬浮液的体积。 14. 进行细胞计数。记录细胞收率（细胞总数）备用。 15. 如果需要，向悬浮液中加入适量 HEPES以达到需要的细胞密度（cells/ml）并再次计数。 16. 利用下面的方程计算成活细胞的数量。 成活细胞数=细胞总数×成活百分率 17. 利用下面的方程计算接种细胞的培养皿总数。培养皿总数取决于细胞收率及接种密度。 如果在孔板上接种，建议接种密度为 10000cells/cm2。 培养皿总数=成活细胞数/生长面积×接种密度 18. 利用下面的方程计算单份培养皿中细胞悬浮液的体积。 单份培养皿中细胞悬浮液体积=稀释细胞悬浮液的体积/培养皿总数 19. 在每个培养皿上注明传代数，细胞株数，细胞类型及日期。 20. 按照 0.2ml/cm2向新的培养皿中慢慢加入新鲜培养基。 21. 用移液管反复抽吸细胞悬浮液确保细胞的均匀分散。按照单份培养皿中细胞悬浮液体积 分装至事先准备好的传代培养皿中。 如果不是使用通风盖，旋松培养皿的盖。将新的传代培养皿放入培养箱中。 换液 1. 接种的转天进行换液，此后隔天进行换液。随着细胞的融合，按照下面的增加培养 基的体积：融合率低于 25%，培养基密度为 0.2ml/cm2。融合率在 25-45%，培养基密度 为 0.3ml/cm2。融合率超过 45%，培养基密度为 0.4ml/cm2。 2. 在无菌容器中准备适量 37℃的培养基。从培养皿中抽去旧培养基，更换为新鲜的温培养 基并放回培养箱。 3. 避免培养基的反复加温和冷却。每次准备的培养基体积够单次换液使用即可。 相关产品 肾脏上皮生长培养基： CC-3190 REGMTM Bulletkit® 套装包括 500ml瓶装 REBMTM （CC-3191）和 REGMTM SingleQuots®（CC-4127） CC-3191 REBMTM 肾脏上皮基础培养基（无生长因子，500ml） CC-4127 REGMTM SingleQuots® 添加剂及生长因子（氢化可的松，表皮生长因子，牛胎儿血清，肾上腺素，胰岛素，三碘甲 状腺原氨酸，转铁蛋白，庆大霉素/两性霉素-B） 产品保证 体外培养的细胞寿命有限。 1. 冻存后培养的 RPTEC具有确保实验使用的 15代群体倍增。 2. 增殖后培养的 RPTEC具有确保实验使用的 10代群体倍增。 3. 超过产品保证次数的群体倍增和传代是可能的，但会导致传代后细胞的生长率下降，生 物响应性和功能的劣化。 4. RPTEC在完全融合后会出现不可逆的接触抑制。为避免细胞的损失，应在细胞达到 80% 融合前进行传代。