结核疫苗研究进展_刘珊珊

中国兽药杂志 2013，47(3) :52 ～ 57，62 /刘珊珊，等 结核疫苗研究进展 刘珊珊，韩文瑜，雷连成，冯 新，孙长江，姚翠梅，高 宇，赵红蕾 (吉林大学农学部畜牧兽医学院，长春 130062) ［收稿日期］2012 － 08 － 24 ［文献标识码］A ［文章编号］1002 － 1280 (2013)03 － 0052 － 07 ［中图分类号］R392 ［摘 要］ 综述了近年来结核疫苗研发过程中宿主抗结核感染免疫机制的研究进展，介绍了结核 疫苗研发策略及已进入临床前期的结核疫苗，同时列举了新的结核疫苗评价，以期为结核疫苗 的进一步研究提供参考。 ［关键词］ 结核疫苗;免疫机制 基金项目:艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项(2008ZX10003 － 005) 作者简介:刘珊珊，博士研究生，从事兽医微生物与免疫学的研究。 通讯作者:韩文瑜。E － mail:hanwy@ jlu． edu Research Progress on Tuberculosis Vaccine LIU Shan － shan，HAN Wen － yu，LEI Lian － cheng，FENG Xin，SUN Chang － jiang， YAO Cui － mei，GAO Yu，ZHAO Hong － lei (College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun，130062，China) Abstract:In this article the progress of the research on anti － tuberculosis(TB)immunological mechanism was reviewed，the strategies and evaluation criteria in the TB vaccine development were also introduced in order to provide reference for further research of TB vaccine． Key s:tuberculosis vaccine;immunological mechanism 我国属结核病高流行地区，结核病人数居全世 界第二位，是全球 22 个结核病高负担国家之一。世 界卫生组织早在 1993 年宣布“全球结核病紧急状 态”。卡介苗(BCG)是牛型结核分枝杆菌强毒株经 13年传代培养获得的减毒株，于 1921 年首次使用。 自从 1974年世界卫生组织正式将其列入免疫接种 以来，已经有约 40 亿剂的卡介苗得到接种。目 前卡介苗仍是唯一的结核疫苗，长期的临床应用验 证其免疫效果大约在接种 10 ～ 15 后年逐渐减弱，对 儿童以及青少年的保护性受到限制。临床试验也证 实，BCG免疫不能对成年人提供良好的保护效果，更 无法预防潜伏性结核感染。因此，临床上迫切需要 新的疫苗来控制结核病的发生发展。 结核疫苗研究的关键是对结核分枝杆菌(MTB) 的致病机制有深入了解。MTB 致病机理复杂，主要 是诱导机体细胞免疫，因此结核病不能像其他疾病 一样应用传统疫苗免疫手段得以有效控制，同时也 不能用传统免疫血清学方法进行有效诊断，目前为 止在疫苗研制和检测方面均未得到突破性进展。基 于此，各国均在加大投入对结核病进行广泛深入研 究。本文对结核疫苗研制进展进行了阐述。 1 抗结核感染相关免疫反应 了解 MTB感染免疫机制有利于合理设计抗结 核疫苗。MTB是胞内感染菌，因其独特的蜡质细胞 壁结构，对于可溶性抗菌成分显示出强烈抵抗作 用，而肺泡内吞噬作用显得尤为重要，机体抗 MTB 感染主要依赖细胞免疫应答，是一类 T 细胞介导 的、以巨噬细胞为主要效应细胞的免疫反应，包括 巨噬细胞吞噬 MTB、抗原递呈、T 淋巴细胞对抗原 的特异性识别结合、抗原增殖和分化、免疫细胞释 放相应细胞因子、巨噬细胞激活和杀菌等。调节性 免疫反应对于结核感染至关重要，能够提供长期的 ·25· 2013，47(3) :52 ～ 57，62 /刘珊珊，等 中国兽药杂志 免疫保护以防止疾病复发。MTB 潜伏感染后在机 体免疫力下降的情况下常常会发生疾病复发甚至 进入急性感染期。可以说机体免疫反应的强度很 大程度上决定了带菌感染者一生的健康。全世界 每年 20 亿结核感染者中，只有 10%会发展为活动 性结核，而剩下的 90%无疑因为患者本身完善的免 疫系统将疾病得以控制［1 － 2］。而免疫反应对于控 制结核的有效作用在结核共感染 HIV 得到另一个 方面的证实:共感染患者中一生中 10%可能发展为 活动性肺结核的几率扩增到 1 年内就有 10%可能 发展为活动性肺结核［3］。 1． 1 抗结核感染相关细胞免疫反应 MTB 进入机 体后被肺吞噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞 吞噬，后者将抗原处理后递呈给 MHC 限制性 T 细 胞［4］。MHC II分子将抗原递呈给 CD4 + T 细胞，而 CD4 + T细胞辅助细胞分化成不同亚群，激发产生 相应细胞因子，通常产生 IFN － γ、IL － 2 和 TNF － α 来进一步激活巨噬细胞。而 MHC I 类分子将相关 抗原递呈给 CD8 + T辅助细胞，进而分化成 IFN － γ 和 TNF － α 来激活巨噬细胞［5］，因 MTB 表面富含 补体受体，感染部位濒死的巨噬细胞吸引着单核细 胞和其他免疫细胞从而形成局部损伤。IFN － γ 信 号同时还能促进吞噬体和溶酶体的融合，从而达到 抵抗 MTB的作用。IFN － γ 对于抵抗结核等胞内 感染是必不可少的，因其能激活巨噬细胞，并产生 毒性分子从而杀死 MTB。激活的巨噬细胞分泌诸 如 TNF － α，IL － 12，IL － 18 等细胞因子。TNF － α 对于诱发其他炎症趋化因子和相应受体是非常有 效的，因此 TNF － α和 IFN － γ是关键细胞因子，能 促进感染性吞噬过程同时也作为评价 TH1 反应的 标准［6 － 7］。而 TNF － α 本身作为一个效应因子可 以协同 IFN － γ来激活记忆 T细胞是机体预防细胞 内病原菌再次感染的基础。而 IL － 2 的共表达对 于抵抗病毒感染从而保护宿主而显得尤为重要 (图 1)［8 － 9］。MTB在巨噬细胞和 DC 细胞中得以 存活，对于结核的有效控制主要依靠巨噬细胞和 T 细胞亚群［10］，诱导记忆 T 细胞产生是高效疫苗必 备条件。 图 1 抗MTB 感染相关的 T细胞亚群［8］ 1． 2 抗结核感染相关体液免疫反应 针对 MTB 产生的抗体，由于无法接触到胞内菌体，只能对释 放出巨噬细胞的细菌发挥作用，因此体液免疫反 应只能起到辅助抗感染作用。体液免疫反应对于 抗结核感染的作用仍没有得到充分了解，最初研 究中发现 B 细胞缺失的小鼠相对于野生鼠并未显 示出高易感性。然而近期研究不断发现，在这些 B 细胞缺陷小鼠中，MTB 滴度和因聚集过多的中 性粒细胞而出现的病理损伤相对高于野生菌［11］。 而抗体在某些情况下对于抵抗 MTB 感染显示一 定作用，在肺结核开放期，MTB 因表面具有宿主 抗 MTB 抗体从而改变其吞噬细胞内化机制，使巨 噬细胞趋化作用提高，增强其吞噬溶酶体作用而 有效杀死 MTB。 ·35· 中国兽药杂志 2013，47(3) :52 ～ 57，62 /刘珊珊，等 1． 3 MTB是通过气溶胶形式传播感染 多数病灶 集中在感染者肺部，因此有效地开发区域黏膜免疫 从而控制结核传播显得意义深重。一些研究已经 验证了黏膜免疫对于抗结核感染的显著作 用［12 － 13］，而该免疫反应通常涉及较为复杂的免疫 机制，包括先天免疫、体液细胞免疫等，同时分泌到 肺部黏膜的抗菌肽抗菌机制也参与其中。 2 结核疫苗研制策略 为了减少全球结核病的广泛蔓延，不断研发新 的疫苗策略，以期达到对成年人和儿童都能提供优 于 BCG疫苗的免疫保护作用。主要研发策略见图 3。后续疫苗不仅能够控制最初感染，而且能够减少 MTB的复制代谢活性，从而将其引入休眠期［14 － 15］。 因此，合适的感染后疫苗也是研发的热点，尤其在 高感染率地区，这样的疫苗显得尤为必需。 A．感染前 BCG免疫策略;B．感染前亚单位疫苗联合 BCG免疫策略;C．感染后亚单位疫苗加强 BCG免疫策略;D． 感染前替代 BCG疫苗免疫 策略;E． 治疗性疫苗策略;F． 异种替代 BCG增强疫苗策略;G． 潜伏感染患者异种替代 BCG增强疫苗策略;H． 感染前抑制稳定感染策略 图 3 结核疫苗研发策略［11］ ·45· 2013，47(3) :52 ～ 57，62 /刘珊珊，等 中国兽药杂志 2． 1 重组 BCG 疫苗和减毒活性结核疫苗 重组 BCG疫苗是将一些重要抗原尤其是 MTB 表面蛋白 相关毒力因子导入 BCG 菌株，如存在于 BCG 缺失 区域 RD1、RD2 等一些具有高度免疫活性抗原基 因，从而得到一个重组 BCG 疫苗，以期能取代传统 BCG 疫 苗，如 rBCGΔureC:Hly (VPM1002)和 rBCG30目前已经进入临床前期。而 MTB 减毒活疫 苗是敲除 MTB的一些基因从而得到基因缺失突变 株，MTB减毒活疫苗因其能够表达多种抗原从而能 激活多功能 T 细胞群亚群，显示出较强的免疫活 性。减毒活疫苗比 BCG 具有更好的保护作用和安 全性［16 － 17］，目前主要的结核重组疫苗以及减毒活 疫苗见表 1。而其他一些减毒疫苗期待在未来几年 内陆续进入临床前期，主要目标设置在基因敲除方 面，比如 MTBVAC01 疫苗是通过敲除转录调控子 phoP相关毒力基因而构建的［18］。 表 1 MTB重组疫苗和减毒疫苗［16］ 重组疫苗和减毒疫苗 研发阶段 研发公司 rBCG30 完成临床 I 加利福尼亚大学 rBCG△reC:Hly 临床 I期 德国马克斯 －普朗克研究所 BCG:RDI 研发中 美国科尔，法国巴黎巴斯德 研究所 MVA －85A 临床 II期 牛津大学 基因敲除疫苗 ICL 研发中 美国 2． 2 亚单位疫苗和活载体疫苗 对 MTB 亚单位 疫苗研究起源于 20 世纪 80 年代，研究发现只有活 的 MTB才能够提供免疫保护作用，而死菌则不能， 原因在于死菌中缺乏一些毒力因子，而这些毒力因 子常常是一些分泌蛋白，并且通过实验证实，这些 分泌蛋白往往通过佐剂能够刺激机体产生强烈的 免疫反应［19 － 20］。尽管随着蛋白组学发展，不断更 新新的方法来分析 MTB早期培养滤液，将近有 100 多种新的表面蛋白被发现［21］，但目前主要亚单位 疫苗候选抗原仍集中在少数几个蛋白上，如 Ag85B、ESAT － 6 和 CFP － 10 等，显然目前对于亚 单位疫苗候选基因筛选工作只做了很小的一部分， 大量工作等待我们去开展。目前 MTB 亚单位疫苗 主要有两种类型，一种是由 2 ～ 3 个 MTB 主要毒力 相关蛋白构成;另一种是表达一个或是多个 MTB 蛋白的活载体疫苗。重组蛋白疫苗需要相关佐剂 辅助来刺激产生 Th1 型免疫反应，而活载体疫苗则 不需要相关的佐剂，目前研发的活载体疫苗能产生 类似 BCG 免疫相关的免疫保护作用，甚至有些对 于灵长类动物显示出良好的免疫保护作用［22］。 Ag85B －ESAT －6、Ag85B － TB － 10． 4(H4，AERAS － 404)、M72、MVA85A、Ad35(AERAS － 402)等都是 这两个类型的候选疫苗［23 － 26］，有的也进入临床一 期。活载体疫苗技术的发展促使产生了更多的疫 苗设计新思路，将痘病毒修饰后做为 DNA 载体来 重组重要抗原，联合 BCG 和禽痘重组 Ag85A 疫苗 能激发出比 BCG 更强的免疫保护力。r － MVA － Ag85 疫苗已经进入临床一期阶段。利用鼠伤寒沙 门氏菌减毒株作为载体，将编码 MTB 保护性抗原 基因导入其中，可构建重组 st疫苗，如 rst － Ag85B; 而将保护基因导入小鼠巨噬细胞或骨髓细胞则可 构建结核活细胞疫苗，如 J774 － HSP65 疫苗。目前 主要的结核亚单位疫苗见表 2。 表 2 MTB 亚单位疫苗［24］ 亚单位疫苗 研发阶段 研发公司 H1 /IC31 临床 I期 丹麦国家血清研究所 Mtb72f /AS02A 临床 I期 葛兰素史克生物制品公司 H1 /LTK63 临床 I期 丹麦国家血清研究所 /诺华制 药公司 HyVac4 / IC31 临床 I期 丹麦国家血清研究所 /Aeras 全 球结核疫苗基金会 J774 － HSP65 / BMC － HSP65 临床 I期 Aeras全球结核病疫苗基金会 2． 3 DNA 疫苗 向宿主体内注射 DNA 载体使宿 主通过自身包装表达机制来表达 DNA 载体中融合 蛋白，从而避免了使用佐剂的副作用，这些抗原通 过递呈 MHC I类相关分子，而诱导 CD4 +和 CD8 + T 细胞免疫反应得到广泛关注［27 － 28］。结核 DNA 疫 苗研究领域中 Ag85 家族研究最为广泛，其中 Ag85A活性最强［29］。有研究甚至建立多价 DNA 疫苗，融合 Ag85B、ESAT － 6、KatG、MPT8． 4、 MPT12、MPT63、MPT64 和 MPT83 蛋白［30］。目前主 要的结核 DNA疫苗见表 3。 表 3 MTB DNA疫苗［31］ DNA疫苗 研发阶段 研发公司 Ag85B，ESAT － 6，MPT － 63 和 MPT － 64 融合 DNA疫苗 研发中 中国 促凋亡 BCG疫苗 研发中 Nashvile VA医学中心 敲除 phoP基因 Mt103 疫苗 研发中 萨拉戈萨大学，法国 巴斯德研究所 mc26030 临床 I期 美 国 卫 生 研 究 院 (NIH) 有研究发现，分泌蛋白对于诱导 DNA 疫苗有 效的保护作用是必需的，同时这种 DNA 疫苗对于 高致病性耐药临床结核分离菌株有高效的保护作 ·55· 中国兽药杂志 2013，47(3) :52 ～ 57，62 /刘珊珊，等 用［31］。Ag85A DNA疫苗也可以作为免疫增强剂， 甚至是细胞因子刺激剂来提高机体免疫力。比如 在给小鼠免疫 BCG 之前给予 Ag85A DNA 疫苗免 疫，保护效果从单独 BCG免疫的 0． 67log 到联合免 疫后的 1． 12log，保护效果显著增强［32］。有研究还 将 IL － 12 基因融合到 Ag85A DNA 疫苗中，从而将 Ag85A DNA 保护效率提高到与 BCG 免疫效果相 当［33］。DNA疫苗的应用除了本身的安全问题，我们 还必须考虑到这种类型疫苗是否可以应用到人类身 上，而病毒编码 Ag85A疫苗对于 BCG免疫的增强效 果在人类身上也得到证实，这无疑是个好的开始， DNA疫苗对于人类至少可以成为有前景的免疫增强 剂，而对于这种疫苗本身的恐惧并不足以抹杀其对 人类免疫提高的显著作用。 2． 4 灭活疫苗 灭活菌体疫苗感染相关疾病的危 险性相对较小，目前结核疫苗研制在这个领域主要 采取两个策略，一是灭活 BCG 载体疫苗，二是选用 一些其他分枝杆菌载体，如热灭活弱毒性分枝杆菌 如 Mycobacterium vaccae，具有安全性同时还能作为 抗结核的免疫治疗剂，而灭活 Mycobacterium vaccae 疫苗已经完成临床 3 期安全实验。临床试验显示， 这类型疫苗能够提高放射疗法和化学疗法的疗效， 大大缩短治疗时间［33］。 2． 5 佐剂研发 佐剂的功能在过去疫苗研制过程 中有所忽视，最近很多研究表明佐剂除了可以增强 疫苗免疫原性(如 DC靶向提呈) ，促进免疫细胞分 化成熟，还在诱导免疫应答倾向(Th1 或 Th2) ，甚 至改变特异性 T 细胞克隆群等过程中都发挥了重 要作用，这对于抗结核感染显得意义重大。在过去 的几年里，实验验证了一些佐剂作为结核疫苗有效 佐剂所具备的有效性和安全性［35］，其中单磷酸酯 质 A(MPL)被广泛应用，尤其与 DNA 疫苗联合使 用时显示更强的保护作用，而新一代的氨基烃基类 MPL佐剂的药效研究正积极展开。目前在结核疫 苗研制领域由此也掀起了一场开发新型佐剂的激 烈战。 2． 6 未来结核疫苗研究方向 未来结核疫苗研究 主要着重两个方向，一是感染后疫苗，靶向潜伏期 MTB，以期来完全消灭潜伏期 MTB，或是降低其复 制感染几率，从而控制疾病的复发，而潜伏表达相 关抗原就成为该类疫苗的候选基因［36］。另一个方 向就是开发 BCG免疫增强剂，以期增强 BCG 免疫 效果，而筛选的增强剂候选基因必须是能完全消灭 MTB的相关抗原，而不是仅仅将其靶向潜伏期。 3 新的疫苗评价标准 对于疫苗评价主要是针对已经进入临床前期的 相关疫苗(表 4) ，通过深入了解 MTB 相关免疫机制 和致病机理，我们必须考虑到这些疫苗的有效性和 安全性。有效性至少要比 BCG强，安全性至少可以 用于 HIV高流行地区，而具体的评定标准见表 5。 表 4 处于临床阶段的结核疫苗及其接种方法［36］ 疫苗 抗原 用药方式 /途径 研发阶段 牛结核分枝杆菌 牛结核分枝杆菌裂解物 免疫 HIV阳性患者以期提高 BCG免疫效果 临床 III期 BCG30 重组疫苗 Ag85B 皮内入射 临床 I期已完成 MVA /Ag85 重组疫苗 Ag85A 肌肉注射作为 BCG免疫增强剂 临床 II期 Mtb72f Mtb32 和 Mtb39 融合疫苗 肌肉注射 临床 II期 Hybrid1 Ag85B和 ESAT － 6 融合疫苗 肌肉注射 临床 II期 rBCGΔreC hly ΔreC hly重组 BCG疫苗 皮内入射 临床前期 AERAS － 402 Ag85A，Ag8 和 TB10． 4 融合疫苗 肌肉注射 临床 I期 表 5 结核疫苗评价标准［36］ 评价 方法 评价方法 安全性 与卡介苗在 I / II / III期临床试验过程中引发的局部和全身 作用相比较 比 BCG更为安全 TH －1 的免疫反应的免疫原性 ELISPOT或细胞内细胞因子染色方法检测分枝杆菌特抗原 异性 γ －干扰素分泌水平 检测与抗原相关的关键免疫因子水平 诱导 T细胞免疫应答 体外分枝杆菌生长抑制实验分析 阻断结核分枝杆菌在巨噬细胞内的复制 诱导体内保护性免疫反应 BCG免疫后，体内攻毒后来观察抑制分枝杆菌复制能力 抑制分枝杆菌在体内复制 诱导结核分枝杆菌特异性的 粘膜免疫 结核分枝杆菌特异性分泌型 IgA和支气管肺泡灌洗液中 细胞 TH －1 细胞反应水平 粘膜免疫能有效抗粘膜感染或传播 有效性 临床 III 期 需要长期大规模的研究，包括选择应试 者进入体内和体外临床 III 期实验 ·65· 2013，47(3) :52 ～ 57，62 /刘珊珊，等 中国兽药杂志 4 展 望 随着来自公共基金、政府机构和各项社会投资 的增加，MTB致病机理、疫苗研发、疾病诊断等方面 研究的不断深入，预计在 2015 年以前会有 20 种左 右新结核疫苗进入临床一期试验，到 2015 年会获 得一种有效、安全、廉价的新结核疫苗，得以在全球 广泛使用。我们有理由相信，经过数代科学家们持 之以恒的努力，到 2050 年有可能达到控制和逐步 消灭结核病的伟大目标［37］。 参考文献: ［1］ Young D DYE C． The development and impact of tuberculosis vaccines［J］． Cell，2006，124(4) :683 － 687． ［2］ Kaufmann S H E． Recent findings in immunology give tuberculosis vaccines a new boost［J］． Trends in Immunology，2005，26(12) : 660 － 667． ［3］ Kaufmann S H E，Mcmichael A J． Annulling a dangerous liaison: Vaccination strategies against AIDS and tuberculosis［J］． Nature Medicine，2005，11(5) :578 － 578． ［4］ Dorhoi A，Kaufmann S H E． Fine － tuning of T cell responses during infection［J］． Current Opinion in Immunology，2009，21 (4) :367 － 377． ［5］ Kaufmann S H E． Essay － Envisioning future strategies for vacci- nation against tuberculosis［J］． Nature Reviews Immunology， 2006，6(9) :699 － 704． ［6］ Newport M J，Huxley C M，Huston S，et al． A mutation in the interferon － gamma － receptor gene and 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