大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
【实验目的】
掌握用 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
【实验原理】
常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌,首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。
受体细胞经一定方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。
【材料和试剂】
DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl2溶液、75%的甘油(以上试剂均需高压灭菌)
【仪器设备】
振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头...
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
【实验目的】
掌握用 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和
。
【实验原理】
常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子,所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌,首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。
受体细胞经一定方法处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。
【材料和试剂】
DH 5α菌株、液体LB培养基、0.1mol/L的CaCl2溶液、75%的甘油(以上试剂均需高压灭菌)
【仪器设备】
振荡培养箱、低温离心机、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头及微量移液器等
【实验步骤】
1、 将 1ml新鲜的16h过夜培养物,转到 100ml LB培养基中。于 37℃ 振荡摇匀 3h(旋转摇床200~300r/min),测量 OD600nm=0.314。
2、 在无菌条件下,将1.5ml细菌培养液转移到冰预冷的Eppendorf管中,在冰上放置10min。
3、 于 4℃用 4000r/min 离心10min。
4、 弃去上清液,将 Eppendorf管倒置 1min,使残留培养液流尽。
5、 各加 150μL冰预冷的 0.1mM CaCl2溶液重悬细胞,合并两管,冰浴10min。
6、 于4℃用 4000r/min离心 10min。
7、 弃上清,将 Eppendorf管倒置 1min,使残留的痕量培养液流尽。
8、 先加入 800μL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞,再加入 25μL预冷的75% 的甘油,之后于 -80℃贮存备用。
【注意事项】
1、 制备过程均需在低温(4℃)下进行,应尽量避免处理的细胞升温或于室温放置过久,否则会严重影响感受态细胞制备的效果。
2、 操作过程需保证无菌状态,若不慎污染,则后续操作将无法正常进行。
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