中和抗体实验

联科生物技术有限公司 www.gotofcm.com 全国免费电话：800 8571 184 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8822 6558 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-5180 5911 联科苏州：0512-6866 6623 联科厦门：0592-5322 2277 联科广州：020-8350 6317 联科武汉：139 9551 1341 联科南京： 025-86609294 17 第三章 中和试验(Neutralization)及中和抗体 简介： 中和试验(Neutralization)是决定中和抗体对相应蛋白(或细胞因子)的生物活性的干涉能力。本 文以中和抗体--兔抗大鼠 TNF-α为例，讲述如何用中和试验来确定此中和抗体对重组 TNF-α蛋 白的生物活性的中和/干涉能力。 原理： 用 TNF-α敏感小鼠 L929 细胞(成纤维肉瘤细胞)的微量细胞毒试验来检测兔抗大鼠 TNF-α(中 和抗体)对重组 TNF-α蛋白的中和能力。因为在无中和抗体存在的情况下，TNF-α对 L929 细胞 有细胞毒杀伤作用，而加入中和抗体后，TNF-α的细胞毒作用会减弱或完全被抑制，即可得知 不同浓度的中和抗体的中和能力的高低。 实验仪器和材料： 小鼠 L929 细胞 RPMI-1640 培养液 细胞因子--重组大鼠 TNF-α，产品标号：400-14，规格：20ug，生产商：Peprotech 中和抗体--兔抗大鼠 TNF-α，产品标号：500-P72，规格：50ug，生产商：Peprotech 培养板 离心机 培养箱 实验： [试剂配制] 细胞因子： 8. 快速离心细胞因子(重组 TNF-α)的冻干粉管，使管盖和管壁上的粉末收集至管 底； 9. 加入无菌的双蒸水 100ul，将细胞因子重悬配制成浓度为 0.2mg/ml的贮存液， 4oC可保存 1 周，如长期保存，则需分装冻存于 -20oC； 10. 取一定量的贮存液(0.2mg/ml)，用 RPMI-1640 培养液进行 1:100,000 稀释，即 获得浓度为 2.0 ng/ml 的重组 TNF-α 工作液。 中和抗体： 1. 快速离心中和抗体(兔抗大鼠 TNF-α)的冻干粉管，使管盖和管壁上的粉末收集至管底； 2. 加入无菌的双蒸水 200ul，将中和抗体重悬配制成浓度为 0.25mg/ml的贮存液，4 oC可 保存 6 个月，如长期保存，则需分装冻存于 -20oC； 3. 根据细胞因子(重组TNF-α)的ED50(半数有效浓度)来确定中和抗体工作液的浓度 此细胞因子(重组TNF-α，产品标号：500-P72，生产商：Peprotech)的ED50 为 0.05ng/ml， 配制的中和抗体工作液的浓度是此ED50的 10000X，5000X，2000X，1000X，500X， 200X，即 500ng/ml，250ng/ml，100ng/ml，50ng/ml和 25ng/ml和 10ng/ml。因此需将 0.25mg/ml的中和抗体贮存液用RPMI-1640 工作液分别作 1:500，1:1000，1:2500， 1:5000，1:10000 和 1:25000 稀释。 联科生物技术有限公司 www.gotofcm.com 全国免费电话：800 8571 184 [检测步骤] 第 1 天： 1. 收集对数生长期的 L929 细胞，用培养液调细胞至适当浓度，加入培养板的小孔中，3 x 104 个细胞/孔； 2. 置 37℃，5％CO2的培养箱中培养 16～24h； 第 2 天： 1. 在一个干净的 96 孔培养板的不同孔中分别加入 50ul 细胞因子工作液和 50ul 各稀释 度的中和抗体； 2. 混匀，并置 37℃，5％CO2的培养箱中孵育 30 分钟； 3. 将第 1 天培养好的 L929 细胞从培养箱取出，小心吸除培养板中的培养液； 4. 从培养箱取出上述加入细胞因子和中和抗体的 96 孔培养板，将孔中 100ul 的细胞因子 和中和抗体的混合液缓慢、小心地加到 L929 细胞上，再在细胞上另加入 100ul 新鲜 的培养液和适当浓度的放线菌素 D； 5. 将细胞培养板放回培养箱中，37℃，5％CO2孵育 18 个小时。 [检测步骤] 1. 从培养箱取出细胞培养板，弃培养液； 2. 经 Hanks 液洗涤后，每孔加入适当浓度的结晶紫染色液； 3. 37℃培养 1h，使活细胞充分着色； 4. 然后各孔加 1％SDS 短时温育使染色细胞溶解； 5. 以酶标测定仪测各孔A570nm值，此值愈小，明培养板中细胞含量愈少，TNF-α的细胞 毒作用越弱，提示中和抗体对重组TNF-α的中和活性越强。另外可将中和抗体的浓度 vs A570nm值作“量-效曲线”图，从而计算出中和率为 50%时的中和抗体浓度，即半数 中和浓度(ND50)。 中和抗体： 美国 Peprotech 公司生产上百种细胞因子的中和抗体，并不断更新，查询请见网站： www.peprotech.com。 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8822 6558 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-5180 5911 联科苏州：0512-6866 6623 联科厦门：0592-5322 2277 联科广州：020-8350 6317 联科武汉：139 9551 1341 联科南京： 025-86609294 18 抗体名称 种属 产品编号 规格 BMP-2 Human 500-P195 50ug/100ug b-NGF Human 500-P85 50ug/100ug 抗体名称 种属 产品编号 规格 IL-1alpha Rat 500-P180G 50ug/100ug IL-1beta Human 500-P21B 50ug/100ug 联科生物技术有限公司 www.gotofcm.com 全国免费电话：800 8571 184 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8822 6558 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-5180 5911 联科苏州：0512-6866 6623 联科厦门：0592-5322 2277 联科广州：020-8350 6317 联科武汉：139 9551 1341 联科南京： 025-86609294 19 抗体名称 种属 产品编号 规格 Cardiotrophin-1 Human 500-P101 50ug/100ug CNTF Rat 500-P79 50ug/100ug CSF Human 500-P44 50ug/100ug EGF Human 500-P45 50ug/100ug ENA-78 Human 500-P91 50ug/100ug Eotaxin Human 500-P41 50ug/100ug Eotaxin Mouse 500-P67 50ug/100ug Eotaxin Mouse 500-P175G 50ug/100ug Eotaxin-2 Human 500-P103G 50ug/100ug Eotaxin-3 Human 500-M32 500ug Eotaxin-3 Human 500-P156G 50ug/100ug Exodus-2 Human 500-P109 50ug/100ug Exodus-2 Mouse 500-P114 50ug/100ug FGF-9 Mouse 500-P66 50ug/100ug FGF-10 Human 500-P151G 50ug/100ug FGF-17 Human 500-P152 50ug/100ug FGF-acidic Human 500-P17 50ug/100ug FGF-basic Human 500-P18 50ug/100ug flt3 Ligand Human 500-P42 50ug/100ug GCP-2 Human 500-P120 50ug/100ug G-CSF Human 500-P43 50ug/100ug G-CSF Mouse 500-P69 50ug/100ug GM-CSF Human 500-P33 50ug/100ug GM-CSF Mouse 500-P65 50ug/100ug GRO-/MGSA Human 500-P92 50ug/100ug GROb/MIP-2 Rat 500-P75 50ug/100ug GRO-beta Human 500-P104 50ug/100ug GRO-gamma Human 500-P105 50ug/100ug IFN-alpha Human 500-P32A 50ug/100ug IFN-gamma Human 500-P32 50ug/100ug IFN-gamma Rat 500-P122G 50ug/100ug IGF-I Human 500-P11 50ug/100ug IGF-I Mouse 500-P157G 50ug/100ug IGF-II Human 500-P12 50ug/100ug IL-1alpha Human 500-P21A 50ug/100ug IL-1alpha Mouse 500-P51A 50ug/100ug 抗体名称 种属 产品编号 规格 IL-1beta Human 500-P21BG 50ug/100ug IL-1beta Human 500-M01B 500ug IL-1beta Mouse 500-P51 50ug/100ug IL-1beta Rat 500-P80 50ug/100ug IL-2 Human 500-P22 50ug/100ug IL-2 Human 500-P22G 50ug/100ug IL-2 Mouse 500-P111 50ug/100ug IL-3 Mouse 500-P53 50ug/100ug IL-3beta Rat 500-P177G 50ug/100ug IL-4 Human 500-P24 50ug/100ug IL-4 Mouse 500-P54 50ug/100ug IL-5 Human 500-P25 50ug/100ug IL-6 Human 500-P26 50ug/100ug IL-6 Mouse 500-P56 50ug/100ug IL-6 Rat 500-P73 50ug/100ug IL-6 Rat 500-P73G 50ug/100ug IL-7 Human 500-M07 500ug IL-7 Human 500-P27 50ug/100ug IL-7 Mouse 500-P57 50ug/100ug IL-8 Human 500-P28 50ug/100ug IL-9 Human 500-P29 50ug/100ug IL-9 Mouse 500-P59 50ug/100ug IL-10 Human 500-P139 50ug/100ug IL-10 Human 500-P20 50ug/100ug IL-10 Mouse 500-P60 50ug/100ug IL-11 Human 500-M11 500ug IL-11 Human 500-P01 50ug/100ug IL-12 Human 500-P154G 50ug/100ug IL-12 Mouse 500-P155G 50ug/100ug IL-13 Human 500-P13 50ug/100ug IL-15 Human 500-P15 50ug/100ug IL-16 Human 500-P06 50ug/100ug IL-17 Human 500-P07 50ug/100ug IFN-r Mouse 500-P119 50ug/100ug IP-10 Human 500-P93 50ug/100ug IP-10 Mouse 500-P129 50ug/100ug 联科生物技术有限公司 www.gotofcm.com 全国免费电话：800 8571 184 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8822 6558 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-5180 5911 联科苏州：0512-6866 6623 联科厦门：0592-5322 2277 联科广州：020-8350 6317 联科武汉：139 9551 1341 联科南京： 025-86609294 20 抗体名称 种属 产品编号 规格 I-TAC Human 500-P132 50ug/100ug JE (MCP-1) Mouse 500-P113 50ug/100ug LIF Human 500-P39 50ug/100ug Lymphotactin Human 500-P40 50ug/100ug MCAF/MCP-1 Human 500-P34 50ug/100ug MCP-1 (MCAF) Rat 500-P76 50ug/100ug MCP-2 Human 500-P35 50ug/100ug MCP-3 Human 500-P37 50ug/100ug MCP-3 Mouse 500-M73 500ug MCP-4 Human 500-P04 50ug/100ug MCP-4 Mouse 500-M70 500ug MCP-5 Mouse 500-P61 50ug/100ug M-CSF Mouse 500-P62G 50ug/100ug MDC Human 500-P107 50ug/100ug MIG Human 500-P50 50ug/100ug MIP-1alpha Rat 500-P77 50ug/100ug MIP-1beta Human 500-P38B 50ug/100ug MIP-2 Mouse 500-P130 50ug/100ug MIP-3 Human 500-P124 50ug/100ug MIP-3alpha Human 500-P95A 50ug/100ug MIP-3beta Human 500-P95B 50ug/100ug MIP-4 Human 500-P108 50ug/100ug MIP-5 Human 500-P123G 50ug/100ug NAP-2 Human 500-P03 50ug/100ug Neurturin Human 500-P102 50ug/100ug NT-3 Human 500-P82 50ug/100ug NT-3 Human 500-P82G 50ug/100ug NT-4 Human 500-P83 50ug/100ug 抗体名称 种属 产品编号 规格 NT-4 Human 500-P83G 50ug/100ug Oncostatin M Human 500-P30 50ug/100ug PDGF-AA Human 500-P46 50ug/100ug PDGF-BB Human 500-P47 50ug/100ug PF-4 Human 500-P05 50ug/100ug Rantes Human 500-M75 500ug RANTES Mouse 500-P118 50ug/100ug Rantes Human 500-P36 50ug/100ug Runt Domain Human 500-P95 50ug/100ug SCF Human 500-P48 50ug/100ug SCF Mouse 500-P71 50ug/100ug SCF Rat 500-P202G 50ug/100ug SCGF Human 500-P99G 50ug/100ug sTNF receptor Human 500-P143 50ug/100ug Tarc Human 500-P97 50ug/100ug Teck Human 500-P134 50ug/100ug TGF-a Human 500-P16 50ug/100ug TNF-alpha Human 500-M26 500ug TNF-alpha Human 500-P31AG 50ug/100ug TNF-alpha Mouse 500-P64 50ug/100ug TNF-alpha Mouse 500-P64G 50ug/100ug TNF-alpha Rat 500-P72 50ug/100ug TPO Human 500-P49G 50ug/100ug Trail/Apo2 Human 500-P135 50ug/100ug Tweak Human 500-P137G 50ug/100ug VEGF Human 500-P10 50ug/100ug VEGF Human 500-P10G 50ug/100ug VEGF Mouse 500-P131 50ug/100ug 注：Peprotech 的中和抗体，除具有中和作用外，还可以用于免疫组织化学、免疫沉淀、Western Blot 和 ELISA 等。欲了解详细情况，请向联科生物技术有限公司咨询(全国免费咨询/订购电话 --800 8571 184)，或登陆 www.peprotech.com 进行查询。