辅酶Q10对紫外线致角膜上皮细胞光损伤的保护作用

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net ·实验论著 · 辅酶 Q 10对紫外线致角膜上皮细胞光损伤的保护作用 苟春风 1 ,刘　勤 2 ,郝保安 1 ,苏兰萍 1 ,王雅东 1 作者单位 : 1 (730000)中国甘肃省兰州市 ,甘肃省康复中心医院 眼科 ; 2 (730000)中国甘肃省兰州市 ,甘肃省人民医院眼科 作者简介 :苟春风 ,女 ,硕士 ,主治医师 ,研究方向 :眼表疾病。 通讯作者 :刘勤 ,主任医师 . summ liu@126. com 收稿日期 : 2009207203　　修回日期 : 2009208210 P ro te c t ive e ffe c t o f co e n zym e Q 10 o n u lt ra v io le t irra d ia t io n 2in d u ce d in ju ry o f ra ts co rn e a l ep ith e lium Chun2Feng Gou1 , Q in L iu2 , Bao2An Hao1 , Lan2P ing Su1 , Ya2D ong W ang1 1Department of Ophthalmology, the Rehabilitation Center Hosp ital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2Department of Ophthalmology, the Peop lepis Hosp ital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China Correspondence to: Q in L iu. Department of Ophthalmology, the Peop lepis Hosp ital of Gansu Province, Lanzhou 730000, Gansu Province, China. summ liu@126. com Received: 2009207203　　Accep ted: 2009208210 A b s t ra c t ·A IM : To e xp lo re th e p ro te c tive e ffe c t o f co e n zym e Q 10 o n u ltra v io le t ( U V ) irra d ia tio n 2in d u ce d in ju ry o f ra ts co rn e a l ep ith e lium a n d its m e ch a n ism s. · M ETHO D S : Fo rty2e ig h t W is ta r ra ts w e re d iv id e d ra n d om ly in to n o rm a l co n tro l g ro up , p o s itive co n tro l g ro up a n d co e n zym e Q 10 g ro up. Th e U V irra d ia tio n 2 in d u ce d d am a g e m o d e l o f W is ta r ra ts w a s e s ta b lis h e d b y e xp o s in g to u ltra v io le t. Th e ra ts in co e n zym e Q 10 g ro up w e re in tra g a s tric a dm in is tra te d b y co e n zym e Q 10 e ve ry2 d a y fo r th re e w e e ks b e fo re a n d d u rin g U V e xp o s u re. Th e ra ts in n o rm a l g ro up d id n o t re ce ive d u ltra v io le t lig h t, and th e ra ts from p os itive g ro up o n ly un de rw en t u ltrav io le t ray w itho u t th e adm in is tra tion of d rug. H is top a th o log ic ch an ges w e re o bs e rved w ith lig h t m ic ros cop y. The co n ten ts o f m a lo n d ia ld e h yd e (M DA ) , s up e ro x id e d ism u ta s e ( SO D ) in th e co rn e a l ep ith e lium w e re m e a s u re d b y p h o tom e try. S ta tis tica l a n a lys is w a s u s e d to a s s e s s re s u lts. · RESU L TS : A fte r U V irra d ia tio n 2in d u ce d in ju ry, th e co n te n t o f M DA in p o s itive co n tro l g ro up w a s in c re a s e d a n d a c tiv ity o f SO D w a s d e c re s e d o b v io u s ly, w h ich s ig n if ica n tly d iffe re d from th e n o rm a l co n tro l g ro up ( P < 0. 01 ) . In co n tra s t to th e p o s itive g ro up , th e co n te n t o f M DA in co e n zym e Q 10 g ro up w a s re d u ce d a n d a c tiv ity o f SO D w a s in c re a s e d ( P < 0. 05) . ·CO N CLU S IO N : Co e n zym e Q 10, b y rem o v in g o xyg e n fre e ra d ica ls , e leva ting the ab ility o f an ti2o x id a tion in co rn ea l ep ith e lium , ca n p ro te c t co rn e a l ep ith e lium a g a in s t U V irra d ia tio n 2in d u ce d in ju ry. · KEYW O RD S : co e n zym e Q 10; co rn e a l ep ith e lium ; u ltra v io le t; irra d ia tio n 2in d u ce d in ju ry Gou CF, L iu Q, Hao BA, et a l. Protective effect of coenzyme Q10 on ultraviolet irradiation2induced injury of rats corneal ep ithelium. In t J O phthalm ol (Guoji Yanke Zazhi) 2009; 9 (12) : 228622288 摘要 目的 :研究辅酶 Q10对紫外线致角膜上皮细胞光损伤的 防护作用及其机制。 方法 : W istar大鼠 48只随机分为正常对照组、阳性对照组 与辅酶 Q10治疗组。紫外线照射建立角膜上皮紫外线光 损伤模型。治疗组于光照前和光照期间每天辅酶 Q10灌 胃 ,共 21d。阳性对照组每天给予等体积的生理盐水灌 胃 ,正常对照组不给任何处理。紫外线照射第 3次后 12h 处死动物取角膜 ,光学显微镜下观察各组角膜组织病理学 改变 ,分光光度法测量角膜上皮组织的 SOD, MDA 的含 量 ,并进行统计学检验。 结果 :角膜上皮紫外线光损伤后阳性对照组 SOD水平下 降 ,MDA水平升高 ,其差异与正常组比较有统计学意义 (P < 0. 01)。与阳性组比较 ,治疗组 SOD水平升高 , MDA含量 降低 ( P < 0. 05)。 结论 :辅酶 Q10对角膜上皮紫外线光损伤具有保护作用 , 机制可能与清除自由基和增强抗氧化能力有关。 关键词 :辅酶 Q10;角膜上皮 ;紫外线 ;光损伤 DO I: 10. 3969 / j. issn. 167225123. 2009. 12. 008 苟春风 ,刘勤 ,郝保安 ,等. 辅酶 Q10对紫外线致角膜上皮细胞光 损伤的保护作用 .国际眼科杂志 2009; 9 (12) : 228622288 0引言 　　紫外线对角膜的损伤是眼科常见的一种损伤。紫外 线对组织有光化学作用 ,能诱发自由基产生和脂质过氧化 物的形成 ,主要通过凋亡 [ 1 ]的形式导致角膜细胞的死亡和 脱落 ,产生强烈的症状如异物感、刺痛、畏光流泪及眼痉 挛。因此 ,对角膜紫外线光损伤防治的药物研究具有重要 意义。本研究旨在利用紫外线消毒灯照射的方法建立紫 外线光损伤的动物模型 ,并在体内应用外源性辅酶 Q10, 检测角膜上皮细胞内自由基清除剂超氧化物岐化酶 ( su2 per2oxide dismutase, SOD )和脂质过氧化物反应产物丙二 醇 (malondialdehyde, MDA)含量的变化 ,探讨辅酶 Q10对 角膜的保护作用及其机制 ,以期为辅酶 Q10在眼科领域 的研究、应用提供理论依据。 1材料和方法 1. 1材料 1. 1. 1动物及分组　健康成年 Wistar大鼠 48只 ,体质量 180～ 250g,雌雄各半 ,双眼无眼疾 ,由甘肃省中医学院实验动物 中心提供。随机分为正常对照组、阳性对照组与辅酶 Q10 治疗组共 3组 ,每组各 16只。 6822 国际眼科杂志 　2009年 12月 　第 9卷 　第 12期 　 www. IJO. cn 电话 : 029 282245172　83085628　电子信箱 : IJO. 2000 @ 163. com © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 1. 1. 2角膜上皮紫外线光损伤模型的制备 　采用贺冰 等 [ 2 ]的方法 ,用波长在 253. 7nm紫外线灯管 12只 , 相隔 15cm分别置于边长 40cm正方形鼠笼中 ,底面的平均照射 度 316J / cm2。10g/L戊巴比妥钠 (40mg/kg)腹腔注射麻醉 , 缝线开睑。紫外线连续照射各实验组大鼠眼部 3d、每 天 5min。 1. 2方法 1. 2. 1给药　辅酶 Q10治疗组 :辅酶 Q10 (上海衡山 药业有限公司生产 )于光照前经灌胃给药 , 1次 / d,连续 21d (灌胃期间的最后 3d 给予紫外线照射 )。剂量为 20mg/kg,药物用蒸馏水稀释至 5mg/mL,灌胃前新鲜配 制 ;阳性对照组 :光照前经灌胃给予同样体积的生理盐水 , 1次 / d,连续 21d (灌胃期间的最后 3d给予紫外线照射 )。 正常对照组 :不给任何处理。 1. 2. 2取材及标本制备 　所有大鼠断脊髓处死后取右眼 全眼球 ,置于 40g/L 多聚甲醛中固定 24h,取角膜组织。 常规脱水、石蜡包埋、切片 ,做 HE染色。分光光度法测量 左眼角膜组织的 SOD,MDA的含量。 1. 2. 3染色 1. 2. 3. 1 HE染色　切片常规脱蜡 ,双蒸水水化 ,常规苏木 精染色 ,盐酸乙醇分色 ,伊红染色 ,显微镜下观察并拍照。 切片取角膜中央 ,以保证切片间的可比性。 1. 2. 3. 2分光光度法测量角膜组织的 SOD ,MDA的含量 　第 3d紫外线照射大鼠眼部 12h后 ,立即断脊髓处死动 物 ,每组大鼠取左眼球。冰上操作 ,用直径 3. 5mm 吸取 200mL /L乙醇的圆形滤纸敷帖角膜中央 20 s,蒸馏水冲洗 2 遍 ,刮取角膜上皮。以分析天平称湿重 ,再用双蒸水配成 20g/L的湿重 ,匀浆。将匀浆倒入试管中 , 3 000 r/m in离 心 15m in,取出上清液测量各指标。 　　统计学分析 :采用 SPSS 11. 5软件包处理数据 ,实验 中各项指标的所有数据均采用以均数 ±标准差 ( €x ±s) 表示 ,组间差异采用单因素方差分析 ,以 P < 0. 05为差异 有统计学意义。 2结果 2. 1形态学观察 2. 1. 1正常对照组　角膜上皮是由 4～6层的非角化的鳞 状上皮构成 ,细胞排列紧密 ,各层排列整齐 ,染色均匀 ,细 胞形态规整。 2. 1. 2阳性对照组 　可见角膜上皮层表层细胞脱离 ,形 成空泡样 ,细胞层数减少 ,仅见 1～2层上皮细胞。高倍 镜 ( 40倍 )下可见细胞核浓染或核质碎裂贴边 ,出现核 周空泡。前弹力层、基质层及以下结构均未见明显 变化。 2. 1. 3辅酶 Q 10治疗组 　角膜上皮各层细胞排列基本 整齐 ,细胞形态基本规整 ,偶可见胞核浓染及核周空泡 形成。各组的角膜组织均未发现白细胞或单核细胞浸 润等炎症反应。前弹力层、基质层及以下结构均未见明 显变化。 2. 2 SOD , MDA的含量检测结果 　角膜上皮紫外线光损 伤后与正常组比较 ,阳性对照组 SOD水平下降 ,而 MDA 升高 ,其差异与正常对照组比较 ,有统计学意义 ( P < 0101)。与阳性组相比较 ,治疗组角膜上皮 SOD水平升 高 ,MDA含量降低 ( P < 0. 05 )。治疗组 SOD水平、MDA 含量与正常对照组比较 ,差异有统计学意义 ( P < 0. 01, 表 1)。 表 1　3组大鼠角膜上皮 SOD活力和 MDA含量的比较 ( €x ±s, n = 16) 组别 SOD MDA 对照组 33. 4 ±0. 4 3. 5 ±0. 2 治疗组 27. 0 ±0. 3b 5. 9 ±0. 3b 阳性组 21. 4 ±1. 5a, b 7. 0 ±0. 2a, b a P < 0. 05 vs治疗组 ; b P < 0. 01 vs对照组。 3讨论 　　许多年来 ,人们对紫外线所致角膜光损伤的发病机制 进行了许多研究 ,很多证据认为自由基连锁反应是造成组 织损伤的核心环节。紫外线由角膜吸收 ,产生大量的氧自 由基 [ 3 ]。自由基是一种具有双向生物学效应的原子或分 子集团。正常情况下 ,在线粒体内电子传递过程中形成少 量 O22,而细胞内自由基清除剂超氧化物岐化酶 ( superox2 ide dismutase, SOD)能使 O22转变为 H2O2 ,后者又通过触酶 及谷光甘肽过氧化物酶的作用还原为水和分子氧 ,故小剂 量的自由基并不造成损伤。但在紫外线照射或其他因素 情况下代谢失衡 ,自由基产生过多 ,机体内的自由基清除 剂不足与之反应 ,导致多种氧化损伤则可引起组织的损 伤。自由基 [ 4 ]通过以下途径攻击细胞而至细胞死亡 : ( 1) 自由基攻击 DNA碱基和 DNA的双链结构、造成 DNA不 可修复的损伤 ; (2)抑制抗氧化酶 ,引发脂质过氧化反应 , 使生物膜中饱和与不饱和脂肪酸比例失衡。 ( 3)使角膜 上皮的 Na + , K+ , ATP 酶失活 ,导致细胞代谢障碍。紫外 线辐射可以诱发角膜缘局部组织细胞中的不饱和脂肪酸 发生脂质过氧化反应 ,脂质过氧化反应中产生的自由基可 与组织中的蛋白质分子相互作用 ,从而使细胞的酶系统失 活影响细胞的代谢。由于自由基的化学性质活泼 ,可以扩 散到生成部位以外的生物分子中 ,使之发生损伤。脂质过 氧化物可使细胞膜的通透性增加 ,线粒体膨胀 ,溶酶体释 放及酶失活 ,进而影响细胞功能 [ 5 ]。紫外线辐射后引起 的脂质过氧化物反应产物还可以导致细胞代谢障碍 ,抑制 细胞的有丝分裂 ,使 DNA解聚。同时 ,它们耗损了大量诸 如 SOD等抗氧化物质 ,使组织抗氧化能力下降。同时动 物实验还证明了经紫外线照射后角膜上皮的丙二醇 (ma2 londialdehyde,MDA,脂质过氧化物反应产物 )含量明显增 加 , SOD含量下降 [ 6 ] ,也证实了上述观点。因此 ,通过测 定 SOD和 MDA的含量变化 ,就可以间接的反映组织过氧 化损伤的情况。辅酶 Q10,别名癸烯醌、泛醌 ,化学名为 2, 32二甲基 252甲基 262癸异戊烯基苯醌 ,是一种脂溶性醌类 化合物 ,具有抗氧化、清除自由基、维持细胞结构完整等功 能。辅酶 Q10存在于线粒体内膜上 , 既是生物体呼吸链 中重要的递氢体 ,又是线粒体氧化磷酸化 ATP形成所需 的重要酶类的关键辅助酶 ,是天然抗氧化和膜稳定剂 , 具 有促进细胞氧化磷酸化、改善能量代谢等多种功能。因 此 ,辅酶 Q10已广泛应用于心血管及神经系统疾病的辅 助治疗中 ,如充血性心衰、心绞痛、高血压病及帕金森病的 治疗 ,并已取得一定成效 [ 7 ]。我们通过组织形态学检查 发现 ,阳性对照组可见角膜上皮层表层细胞脱离 ,形成空 泡样 ,细胞层数减少 ,仅见 1～2层上皮细胞。高倍镜 ( 40 倍 )下可见细胞核浓染或核质碎裂贴边 ,出现核周空泡。 而辅酶 Q10治疗组角膜上皮各层细胞排列基本整齐 ,细 胞形态基本规整 ,偶可见胞核浓染及核周空泡形成。 SOD,MDA的含量检测结果显示 :角膜上皮紫外线光损伤 7822 In t J O phtha lm ol, Vol. 9, No. 12, D ec. 2009　 www. IJO. cn Tel:029282245172　 83085628 　Ema il: IJO. 2000@163. com © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 后与正常组比较 ,阳性对照组角膜组织中 SOD活力下降 , 而 MDA含量升高。与阳性组相比较 ,辅酶 Q10治疗组角 膜上组织中 SOD活力升高 ,MDA含量降低。表明给予外 源性辅酶 Q10对光损伤后的角膜组织 SOD活力和 MDA 含量有显著的影响。我们从病理形态学和生物化学的角 度 ,证实辅酶 Q10对角膜上皮细胞的紫外线光损伤具有 保护作用 ,机制可能与清除自由基和增强抗氧化能力 有关。 参考文献 1 Pauloin T, Dutot M, Joly F, et al. H igh molecular weight hyaluronan decreases UVB2induced apop tosis and inflammation in human ep ithelial corneal cells. M ol V is 2009; 15: 5772583 2贺冰 ,宋志扬 ,宋忆淑 ,等. 人工模拟酶对紫外线造成眼前段损伤的 保护作用. 眼科研究 2002; 20 (5) : 3952396 3 Lodovici M, Raimondi L, Guglielm i F, et al. Protection against ultra2 violet B2induced oxidative DNA damage in rabbit corneal2derived cells ( SIRC) by 42coumaric acid. Toxicology 2003; 184 (223) : 141 4 Valko M, Izakovic M, Mazur M, et al. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. M ol Cell B iochem 2004; 266 (122) : 37256 5方允中. 自由基与酶. 北京 :科学出版社 1989: 63265, 1502168 6 Dem ir U, Dem ir R, Ilhan N. The p rotective effect of alpha2lipoic acid against oxidative damage in rabbit conjunctiva and cornea exposed to ul2 traviolet radiation. Ophthalm ologica 2005; 219 (1) : 49253 7 Pepe S, Marasco SF, Haas SJ, et al. Coenzyme Q10 in cardiovascular disease. M itochondrion 2007; 7 (1) : 1542167 ·病例报告 · 儿童 M a rcus2Gunn综合征合并 眼肌型重症肌无力 1例 张培元 ,张玉琴 ,刘丽珍 作者单位 : (300074)中国天津市儿童医院神经内科 作者简介 :张培元 ,毕业于天津医科大学 ,主治医师 ,研究方向 : 小儿神经内科。 通讯作者 :张培元. zhang2yidi@163. com 收稿日期 : 2008212218　　修回日期 : 2009211203 张培元 ,张玉琴 ,刘丽珍. 儿童 Marcus2Gunn综合征合并眼肌型 重症肌无力 1例.国际眼科杂志 2009; 9 (12) : 2288 1病例报告 　　患儿 ,男 , 3岁 ,生后 2月龄发现左上眼睑下垂 ,无朝 轻暮重现象 ,张口时左上睑上提 ,吃奶时随吸吮动作左上 眼睑瞬动 ,眼裂增大超过右眼。近 1mo患儿左上睑下垂 程度加重伴左眼内收受限 ,近 1wk出现右上眼睑轻度下 垂 ,朝轻暮重现象不明显。患儿系 G2 P2 ,足月顺产 ,无外 伤史 ,其父母及一姐体健 ,无类似病史。查体 :发育正常 , 精神反应好 ,心肺腹无异常 ;左上眼睑明显下垂 ,左眼内收 受限 ,右上眼睑轻度下垂 ,张口时左上睑上抬 ,眼裂瞬间明 显增大 ,余颅神经检查无异常 ,四肢肌力肌张力正常 ,腱反 射正常 ,病理反射 ( 2)。予甲基硫酸新斯的明 0. 5mg肌注 30m in后 ,右眼睑下垂好转 ,左眼睑下垂恢复至既往水平 , 左眼内收正常 , 1h后恢复至用药前表现。辅助检查 :心电 图正常 ,胸腺 CT未见异常 ,肌电图及神经电图正常 ,神经 重复电刺激四肢肌肉未见衰减 ,眼肌见 4%衰减。血化验 细胞及体液免疫未见异常。诊断 : Marcus2Gunn综合征伴 发眼肌型重症肌无力。予服用溴吡斯的明 30mg 3次 /d, 阿赛松 20mg 1次 / d,随访 2mo时 ,眼裂大小恢复至既往水 平 ,眼球活动无受限 ,仍可见张口时左眼睁大超过右眼 ,咀 嚼时左眼瞬动 ,目前随访 0. 5a,病情稳定。 2讨论 　　Marcus2Gunn综合征又名下颌 2瞬目综合征 ,属先天性 睑下垂一种特殊类型 ,表现为单侧上睑下垂 ,当张口或下 颌移向对侧时 ,下垂上睑上提 ,咀嚼时 ,眼睑随之瞬动。现 认为 Marcus2Gunn综合征为不规则的常染色体显性遗传 或隐性遗传 ,病因可能为神经联系异常 ,动眼神经支配的 提上睑肌与三叉神经支配的翼外肌 ,在中枢神经系统中支 配两者神经间有异常的联系。司张口运动的翼外肌收缩 时 ,则出现张口与举上睑的联合运动。涂慧芳等 [ 1 ]在手术 治疗此类疾病中发现提上睑肌与上方等周围组织有诸多 条索粘连 ,这些粘连的条索可能就是异常联系的神经通 道。提上睑肌高位断离与额肌瓣吻合术切断了动眼神经 与三叉神经的异常联系 ,并重建了提上睑的功能 ,能取得 理想的效果。儿童重症肌无力 (myasthenia gravis, MG)最 为常见类型及首发表现为单纯眼肌型 ( oMG) ,眼外肌麻 痹表现上睑下垂 ,可累及单侧或双侧 ,其次为眼球活动障 碍和复视 ,可见朝轻暮重现象 ,并胸腺瘤者少见 ,自身抗体 滴度低 [ 2 ]。在婴幼儿期发病者需与先天性睑下垂疾病鉴 别 ,延误药物治疗会增加患儿转为全身型 ( gMG)重症肌 无力的危险 [ 3 ]。本例患儿在先天性睑下垂的同一眼睑出 现肌无力表现 ,肌肉的易疲劳性及可复性特点不明显 ,值 得注意的是 ,即便在未予新斯的明之前 ,虽然患儿在主动 睁眼左侧眼睑不能上抬 ,但张口时 ,眼裂仍可瞬间睁至最 大 ,反复张口无睁大眼裂变小现象 ,为初诊的鉴别诊断带 来困难 ,查体发现伴有同侧内直肌麻痹 ,以及新斯的明试 验的结果 ,使患儿重症肌无力眼肌型临床诊断确立。 参考文献 1涂慧芳 ,曾宪武 ,喻长泰. 提上睑肌松解及徙前术治疗下颌瞬目综 合征. 中国实用眼科杂志 2004; 22 (11) : 928 2张巍 ,李柱一. 眼肌型重症肌无力的研究进展. 神经损伤与功能重 建 2007; 2 (2) : 114 3李保华 ,唐爱萍 ,姜海平. 小儿重症肌无力 1381例临床综合分析. 中国实用儿科杂志 2000; 15 (5) : 283 8822 国际眼科杂志 　2009年 12月 　第 9卷 　第 12期 　 www. IJO. cn 电话 : 029 282245172　83085628　电子信箱 : IJO. 2000 @ 163. com