植物根系分泌物化感作用研究方法综述_高红春

植物根系分泌物化感作用研究方法综述 高红春1 , 李富恒1 3 , 周艳丽2 　(1. 东北农业大学生命科学学院 ,黑龙江哈尔滨 150030 ;2. 吉林农业大学园艺学院 吉林长春 130118) 摘要　着重讨论根系分泌物的收集、化感物质的分离、化感物质的鉴定以及生物测定的常用方法。 关键词　根系分泌物 ;化感作用 ;研究方法 中图分类号　S312 　　文献标识码　A 　　文章编号　0517 - 6611(2008) 21 - 08902 - 04 Review on the Study Methods for Root Exudates Allelopathy GAO Hong2chun et al 　(College of Life Sciences ,Northeast Agricultural University , Harbin ,Heilongjiang 150030) Abstract 　The methods of the study of root exudates allelopathy , including collection ,isolation and identification were reviewed. Key words 　Root exudates ; Allelopathy ; Study method 作者简介　高红春 (1978 - ) ,男 ,江苏启东人 ,硕士研究生 ,研究方向 : 植物发育生理。3 通讯作者 ,教授 ,博士生导师。 收稿日期　2008204228 　　植物根部能分泌化学物质早已被证实[1] ,植物根部分泌 的化学物质具有各种各样的功能 ,其中至少部分根系分泌物 或其进一步分解物是显示化感作用的[2 - 4] 。在根系分泌物 化感作用研究中 ,对根系分泌物的收集、化感物质的分离、化 感物质的鉴定及生物测定等的研究方法始终是该研究领域 的前沿和难点之一。根系分泌物组成复杂 ,影响因素众多 , 要获得准确可靠的试验结果 ,选择科学的研究方法就显得尤 为重要。根系分泌物化感作用的研究方法主要包括根系分 泌物的收集、化感物质的分离、鉴定及生物测定等方法。 1 　根系分泌物收集方法 目前 ,根系分泌物的收集方法多种多样 ,具体可以将根 系分泌物收集方法分为 :溶液培养收集法、水浸提培养基质 (蛭石培、砂培、琼脂培、土培等)收集法、分根装置收集法、自 动连续装置收集法、多孔陶头塑料管减压原位收集法、层析 滤纸或纤维素膜定位收集法、土壤溶液取样器收集法、同位 素标记结合土壤溶液取样器收集法及其一些衍生的方法等。 1. 1 　溶液培养收集法　根系分泌物常用的收集方法是溶液 培养收集法。该方法首先要培育幼苗 ,先将种子和栽培基质 消毒、灭菌 ,然后将吸涨的种子播种到基质中发芽 ,待幼苗生 长到一定大小时 ,移至蒸馏水或营养液中 ,使之生长一段时 间 ,然后将植株移走 ,收集其培养液 ,过滤 ,即为所收集的根 系分泌物。由海霞等利用该方法研究了不同作物根系分泌 物对黄瓜的化感作用 ,结果明 ,玉米是黄瓜种植最适宜的 前茬作物 ,其次是油菜和小白菜 ,而豇豆、豆角和黑豆等豆科 作物不宜作为黄瓜种植的前茬作物[5] 。阎吉昌等鉴定了由 水培试验方法获得的 2、8 周大豆根分泌物的二氯甲烷提取 物 ,并对其化感作用进行了初步研究[6] 。张凤丽等也利用该 方法对嫁接茄子根系分泌物的化感效应进行了研究 ,表明生 产中使用嫁接技术是缓解由自毒作用引起的连作障碍的有 效方法之一[7] 。 特定营养液收集是指将植株苗放置在缺乏或过量特定 元素的完全营养液生长一段时间后 ,收集其营养液 ,即为所 收集的根系分泌物[8 - 9] 。李明等采用正交设计收集了大量 元素 (N、P、Ca、Mg、K和 S) 胁迫条件下的南瓜根系分泌物 ,研 究了南瓜的自毒作用 ,发现不同的营养条件对其根系分泌物 的影响不同 ,营养元素的合理搭配可以减轻自毒作用[10] 。 该方法的不足之处是所收集到的根系分泌物成分多 ,种类复 杂 ,很难对特定未知的化感物质进行分离鉴定 ,而且部分养 分离子很可能会与根系分泌物的某些成分发生化学反应。 1. 2 　水浸提培养基质收集法　基质培养收集根系分泌物时 常用的基质有 :石英砂、琼脂、蛭石和土壤等。由于石英砂本 身不含植物生长所需的有效成分 ,惰性较强 ,不易与根系分 泌物各组分进行化学反应 ,因此常被用于根系分泌作用 研究。 石英砂培养收集方法 :先用 2 mol/ L 盐酸浸泡石英砂 48 h ,之后用自来水冲洗至中性 ,再用蒸馏水淘洗数次。将种子 播在石英砂上 ,生长一定阶段后 ,用蒸馏水洗砂 ,再浓缩过滤 即为根系分泌物。在砂培条件下 ,植物的通气状况较好 ,生 长时不需要支撑物 ,根系在该条件下的生长状况比水培好。 砂培条件下生长 30 d 的紫茎泽兰根系分泌物对旱稻幼苗有 化感抑制作用 ,生长 20、10 d 的根系分泌物则表现出一定的 化感抑制作用或抑制作用不显著[11] 。 琼脂培养收集方法 :将植株幼苗置于琼脂介质中 ,生长 一段时间后 ,收集根系周围以及附着在根系上的琼脂 ,加热 溶解 ,过滤 ,收集其过滤液即为根系分泌物。琼脂培养收集 根系分泌物时 ,应注意防止微生物污染。李明等采用琼脂培 养的方法研究了南瓜组培根在不同生长时期与不同营养胁 迫下根系分泌物对南瓜、萝卜和小麦 3 种受体的种子萌发及 幼苗生长的化感作用[12] 。曾任森等将供体植物蟛蜞菊种在 含有琼脂的 Hoagland 营养液中 ,培养一定时间后将受体植物 直接播种在周围 ,测定蟛蜞菊的化感作用[13] 。张晓珂等以 东北地区 33 个不同来源的小麦品种为研究对象 ,采用琼脂 共培法 ,评价了不同小麦品种对黑麦草所产生的化感作 用[14] 。Hoffland 用琼脂栽培葡萄 ,收集了磷胁迫条件下不同 部位的有机酸分泌物 ,结果表明 ,供磷条件下 ,葡萄根尖的柠 檬酸、苹果酸分泌量显著高于根系基部 ,而对应部位在缺磷 条件下 ,2 种酸的分泌量要比供磷条件的低[15] 。除了石英砂 和琼脂外 ,利用蛭石或人造营养土栽培植物也能收到良好的 效果。甄文超等将生根草莓幼苗定植于蛭石中 ,培养 60 d 后 ,用蒸馏水浸提蛭石 ,收集根系系分泌物进行自毒作用研 究[16] 。 土培条件下收集根系分泌物比溶液收集麻烦 ,传统的方 法是 :将植物种植于土壤中 ,生长一段时间后直接获取根际 安徽农业科学 ,Journal of Anhui Agri. Sci. 2008 ,36 (21) :8902 - 8905 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　姜丽　责任校对　卢瑶 土壤 ,加入少量杀菌剂 ,将其与无菌水按一定比例混合 ,振荡 或离心 ,过滤 ,所得滤液 ,即为根系分泌物 ;或将生长一段时 间后的植株根系 ,用蒸馏水淋洗 ,所得根系淋洗物即为根系 分泌物。该法能反映整个根系的分泌状况 ,但不能够反映根 系具体部位的分泌特征 ,所获得的分泌物成分复杂 ,不便于 比较研究。 1. 3 　其他方法 　除上述 2 种方法外 ,一些学者根据研究目 的的不同 ,自行设计一些系统或装置来收集根系分泌物 ,如 循环水根系分泌物收集装置以及多孔陶头塑料管减压原位 收集装置、层析滤纸或纤维素膜定位收集法、同位素标记结 合土壤溶液取样器收集法及微透析技术等。Lipton 等采用自 制的根系分泌物收集装置研究了磷营养对植物根分泌有机 酸种类和数量的影响[17] 。贾黎明等采用循环水根系分泌物 收集装置进行根系分泌物的收集 ,结果表明 ,采用该装置能 作到在现实栽培条件下无损根系、实时、连续、富集、定量、准 确收集和研究根系分泌物[18] 。孔垂华等采用连续性根系分 泌物收集系统和树脂吸附方法证明了水稻幼苗根系分泌物 中含有抑制稗草和异型莎草的多种化感物质 ,而且还证明水 稻幼苗的根不是化感物质积累的主要场所 ,但却是它们释放 到环境中去的主要路径[19] 。何海斌等也运用循环法收集了 水稻土培和石英砂培的根系分泌物 ,比较了 2 种水稻根系分 泌物中化感物质的异同[20] 。刘秀芬等采用土壤溶液取样器 从根际土壤中分离出对叔丁基苯甲酸 ,它是一种较强的化感 物质[21] 。田中民以白羽扇豆为材料 ,在液体培养条件下采 用滤纸片原位收集法获取白羽扇豆根系分泌物 ,同时收集其 相应根组织及茎伤流液 ,来确定白羽扇豆根系分泌有机酸的 真实状况[22] 。Neumann 等应用纸膜提取法定位收集了白羽 扇豆的根系分泌物[23] 。姜培坤利用14CO2 饲喂檫树苗 ,收集 培养液 ,成功地对檫树苗根系分泌物进行了动态分析[24] 。 Mehary 用14CO2 标记黑麦草 ,成功地进行了土壤微生物作用 下根系分泌物的研究[25] 。 目前 ,对于一些有效的收集技术仍处在探索阶段 ,如将 广泛应用在医学上的微透析技术用于收集根系分泌物将是 根分泌物收集的一个重大突破。微透析技术是将膜探针 (由 纤维素、聚丙烯腈和聚碳酸酯等膜制成) 直接插到生物活体 部位进行采样 ,不影响和损害生物的生长。如果该方法可行 的话 ,将达到在非伤害条件下对活体进行多部分多组分取 样 ,这也正是根分泌物收集的最理想的方法。此外 ,微透析 技术也可以和色谱等仪器联用 ,使采集和分离鉴定一体化得 以实现。 2 　根系分泌中化感物质的分离 除了收集技术外 ,根系分泌中化感物质的分离鉴定技术 对于根系分泌物化感作用的研究也是十分重要的 ,它们是确 定关键化感物质的重要步骤。利用化学方法对根系分泌物 中的化感物质进行确证是十分必要的。根系分泌物中的大 部分物质是有机物质 ,其分离比无机物质的难度大。迄今为 止还没有一种方法能够直接从样品中检测未知成分 ,直接收 集的根系分泌物不能直接用于分析 ,必须经过预处理后才能 作定性和定量分析。在根系分泌物的化感物质的分离和鉴 定中 ,分离是极为关键的一步 ,如果不能够对根系分泌物进 行有效的分离 ,就会影响未知组分的结构鉴定和成分分析。 目前 ,常被采用的分离方法包括萃取法、树脂法、层析法、分 子膜及超滤技术。 2. 1 　萃取法 　根据化感物质在 2 个不相溶或部分互溶的溶 剂中的分配 (溶解度) 不同而达到分离纯化的目的。该法虽 然操作繁琐 ,但由于所用器械简单方便 ,快速易行 ,现在仍被 广泛使用 ,常用有机溶剂有乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷等。 强化感水稻品种 PI312777 和弱化感水稻品种 Lemont 的根系 分泌物的乙醚萃取物中均检测到含有化感物质含氧萜类化 合物 ,但在土壤和石英砂介质中存留方式和数量存在差 异[26] 。柴强等用二氯甲烷萃取小麦、玉米和鹰咀豆水培 45 d 幼苗的根系分泌物 ,并对各根系分泌物在不同播种模式中的 化感作用进行了研究[27] 。 2. 2 　树脂法 　这是近年来发展起来的一种新方法 ,根据分 离机理的不同 ,分为交换法和吸附法。交换法是利用阳离子 和阴离子树脂吸附阴阳离子 ,无极性或极性较弱的有机分子 通过 ,然后洗脱和提取目标组分 ,从而达到纯化的目的。吸 附法则是使用吸附树脂 (如 XAD24、XAD22 或 GDX2102 树脂、 活性炭以及硅胶等) ,吸附和富集含化感物质在内的一些有 机化合物 ,进行分离和纯化[28 - 30] 。Tang 等设计的在水培或 砂培系统中用 XAD - 4 树脂收集未受干扰的根所产生的分 泌物 ,再用甲醇洗脱树脂中吸附的物质 ,进而测定根系分泌 物对受体的生物活性和对根系分泌物进行分离和鉴定[31] 。 该方法目前在国际上已经得到较广泛应用程智慧等采用 XAD24 吸附树脂法对线辣椒植物水浸液进行吸附 ,然后分别 用乙醚、50 %乙醚 + 50 %乙酸乙酯、乙酸乙酯、50 %乙酸乙酯 + 50 %甲醇、甲醇、蒸馏水洗脱分离 ,测定各组分的生物活 性 ;黄瓜根系分泌物也是采用 XAD24 吸附树脂进行吸附 ,然 后用甲醇洗脱 ,再进行分析和鉴定[32] 。刘秀芬等在分离根 际他感化学物质时首先采用 GDX2102 树脂吸附土壤溶液 ,再 用甲醇淋洗 ,然后收集淋洗液用于生物测定和鉴定[21] 。 2. 3 　层析法　利用混合物中各组分在固定相和流动相中分 配平衡常数的差异 ,在多次反复平衡过程中 ,使各组分在固 定相中得到了分离。自从 Bulen 在 20 世纪中叶提出用柱层 析测定植物组织中的有机酸后 ,层析法便被广泛地用于土壤 中化感物质之一的有机酸的研究[33] 。柱层析法手续繁琐 , 且时间长 ,而纸层析和薄板层析法虽然操作简便 ,但是不够 精确 ,所以它们现在基本上已经不作为检测手段了。 2. 4 　分子膜与超速离心法　分子膜与超速离心分离技术已 经在根系分泌物研究中广泛应用 ,如利用分子膜结合超滤技 术可以对根系分泌物的蛋白质、氨基酸及多肽进行有效分 离。由于不同分子量的分子膜孔径一般介于 0. 001～1. 000 μm ,因此利用分子膜超滤 ,可以将分泌物中的细菌、蛋白质甚 至病毒进行分离 ,防止微生物对根系分泌物的降解作用。超 速离心技术可以将理化性质相近、分子量差异大的根系分泌 物进行有效分离 ,其原理主要根据不同根分泌物组分离心力 不同而分布于不同层面上达到分离。 3 　根系分泌物中化感物质的鉴定方法 分离纯化根系分泌物是为了更好地对未知组分进行鉴 定。用于物质鉴定的常用仪器有 :紫外 - 可见光谱仪、红外 309836 卷 21 期　　　　　　　　　　　　　　　　高红春等　植物根系分泌物化感作用研究方法综述 光谱仪、气相色谱仪 ( GC) 、液相色谱仪 (LC) 、离子色谱仪、质 谱仪 (MS)和核磁共振仪等。 3. 1 　结构的鉴定 　近年来 ,由于近代实验物理方法在化学 分析上的应用 ,给新发现的化感物质结构的测定带来了比较 简单而准确的方法。根据测定熔点、红外光谱、紫外光谱、质 谱和核磁共振谱 (1H2NMR 和13C2NMR)等参数 ,来判断其中存 在的功能团、共轭体系、该未知物质的分子量和结构以及 H 原子和 C原子在分子中的结合方式等信息 ,确定其化学结 构 ,最后根据测定的结构用已知的标样或合成的标样来鉴定 结果。其中 ,核磁共振波谱是结构分析中最理想的方法 ,它 能够给出化学位移 ,自旋耦合裂分模式以及积分线高度等信 息 ,能够对分子空间构型及各类结构单元的联结方式进行准 确测定 ,预见性好。 3. 2 　成分的鉴定　由于化感物质主要是植物的次生代谢产 物 ,量甚微 ,而且有的易挥发或在空气中易发生化学反应 ,因 而 ,其检测方法在很大程度上依赖于科学技术的进步。伴随 着科学技术的不断发展和现代化仪器设备的更新换代 ,特别 是电脑分析控制程序的普遍应用 ,利用 GC、高压液相色谱仪 (HPLC)和气相色谱 - 质谱联用仪 ( GC/ MS) 及液相色谱 - 质 谱联用仪 (LC/ MS)研究化感物质获得了很大的发展。其中 , 一般 GC分析的物质 ,其沸点在 500 ℃以下 ,分子量要少于 450 ,而对热稳定性差、易于分解、变质以及具有生理活性的 物质 ,都不适合 GC 检测 ,它所分析的物质占有机物总数的 15 %～20 %;而 HPLC的使用范围较广 ,可以检测的物质占有 机物总数的 80 %～85 % ,但在 HPLC 广泛应用的同时 , GC 仍 然发挥着重要作用。把色谱仪的分离装置作为质谱仪的进 样系统 ,把质谱仪作为色谱仪的检测系统 ,即把色谱仪的高 分辨率和质谱仪的高鉴别能力结合起来 ,组成 GC/ MS 或 LC/ MS仪器 ,是目前解决复杂未知物定性问的最有效工具 之一。其中 ,对LC/ MS联用技术而言 ,因目前液相色谱仪大 多采用紫外监测器 ,这样将许多不能显示紫外吸收的有机 物 ,如糖及饱和有机物排除在外 ,因而液相色谱仪上显示的 色谱峰并不能够代表所测样品的全部化学成分。尤其是 LC/ MS的质谱解析需要较强的专业背景 ,而且目前的LC/ MS 并不像 GC/ MS 那样有质谱库供参考 ,这就更增加了难度。 采用田间种植方式收集的根系分泌物成分复杂 ,往往会有几 十个、上百个检测峰 ,而且许多是未知物。这些粗提物立即 用LC/ MS检测鉴定是不现实的 ,因而用 GC/ MS 作前期检测 分析 ,可以快速给出物质种类 ,然后再对具有潜在价值的化 感物质进行针对性的LC/ MS鉴定 ,这可能是目前比较方便和 可行的研究手段。 4 　根系分泌物化感物质的生物测定方法 生物测定技术常常被用于鉴定分离出的物质是否具有 化感作用。对于化感物质的生物测定多采用通过观察受体 (土壤生物或其他植物体) 对根系分泌物中化感物质不同程 度的反应 ,从而判断根分泌物中化感物质生物活性的大小。 目前 ,比较常用的生物测定方法有种子发芽试验 ,幼苗生长 发育测定 ,田间试验测定、盆栽试验等。 对于根系分泌物中化感物质的研究 ,很多学者已经从发 芽测定方法上作了大量的工作 ,主要是利用作物生长分泌的 化感物质直接作用于受体作物种子或人工分离土壤中的化 感物质 ,然后作用于受体作物 ,根系分泌物大都与土壤结合 在一起 ,这就应考虑到微生物的作用。微生物可能对化感物 质的成分和含量有一定的影响 ,因此 ,应尽量排除土壤微生 物的干扰。曾任森等用 1/ 2 强度的斯泰耐营养液加 1 %琼脂 制成培养基 ,培养蟛蜞菊茎节 40 d 后 ,每烧杯放 30 粒萝卜种 子和 30 粒黄瓜种子 ,进行发芽试验 ,发现萝卜种子和黄瓜种 子的发芽明显受阻[13] 。张宝琛等将披碱草与细叶亚菊种子 以不同的比例放在同一培养皿中进行发芽试验 ,结果表明披 碱草对细叶亚菊种子的发芽有促进作用 ,而细叶亚菊对披碱 草种子的发芽有抑制作用[34] 。张淑香等分别向培养皿中加 入重茬 3 年、重茬 1 年与正茬土壤浸提液 ,然后播入大豆种 子 ,测定发芽种子胚根伸长量 ,结果表明 ,在重茬 3 年的土壤 上大豆胚根长度远低于其他各处理 ,且差异达到极显著 水平[35] 。 化感作用的生长发育测定一般以胚根、下胚轴或胚芽鞘 的伸长、幼苗的干重和鲜重增加率等指标来表示 ,但很多研 究者把这些指标与种子发芽率结合起来反映化感作用的特 性。幼苗生长发育测定的敏感性一般比种子发芽要好 ,测定 比较准确 ,但缺点是该方法需要较多的化感物质 ,而许多化 感物质的分离提纯非常困难。当化感物质数量有限时 ,可以 采用琼脂培养法或组织培养法。Leather 等应用琼脂培养法 , 将催芽的种子放入含有一定浓度的化感物质或抽提物的琼 脂试管 ,结果胚根和幼苗生长可以在未受损伤的情况下很容 易测得 ,幼苗也很容易移出来进一步分析。靳月华等利用组 织培养方法研究了柳树根系分泌物的他感作用[36] 。 实验室模拟试验可以评估某种植物是否具有化感作用 , 但要确认观察到的化感作用是否在田间被表达出来的话田 间试验是必不可少的。田间试验主要采用附加栽培法和置 换栽培法来研究植物地下部分间的相互作用。附加栽培法 是将 2 种植物混植 ,固定一种植物的种植密度 ,而变化另一 种植物的种植密度的栽培方法 ;置换栽培法是将 2 种植物混 植 ,固定总的种植密度 ,而改变种植比例的栽培方法。 采用循环培养液法测定根系分泌物对受体植物生长发 育的影响也是很有效的一种方法。用水培或砂培法将供体 植物种植在高处 ,将受体植物种植在低处 ,然后将供体植物 的根系分泌物连同营养液不断渗滴到受体植物根部。最后 将最下面的受体培养槽中的水培液用气泵打到最高的供体 植物培养槽中 ,不断循环 ,培养一段时间 ,测定供体根系分泌 物对受体生长发育的影响。 另外 ,也可以采用水培共培养的方式来研究根系分泌物 的化感作用。周志红等利用水培法测定了番茄根系分泌物 对黄瓜幼苗生长的影响 ,结果表明 ,番茄根系分泌物对黄瓜 的苗高及叶面积均有显著的抑制作用[37] 。Mortley 等研究了 甜薯和花生在水培条件下共生长的生物相容性问题 ,结果表 明 ,花生可以通过根部分泌化感物质来促进甜薯生长[38] 。 参考文献 [ 1 ] ELROY A. 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