痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建

和扩增条件 引物由上海华诺生物技术有限公司合成。 引物 ;# 和 ;! 用于扩增 3/4 抗性基因，上游和下游引物中分别 加入 5/6!和 7’4N"酶切位点。引物 4# 和 4! 用于扩增 !48 (O 同源臂，上游和下游引物中分别加入 %/04!和 5/6!酶切位点； 引物和 4- 用于扩增 !48 PO 同源臂，上游和下游引物中分别加入 7’4N"和 9!+!酶切位点。引物 1# 和 1! 用于扩增 !"#$ (O 同 源臂，上游和下游引物中分别加入 %/04!和 5/6!酶切位点；引 物 1P 和 1- 用于扩增 !"#$ PO 同源臂，上游和下游引物中分别 加入 7’4N"和 9!+!酶切位点。引物 Q# 和 Q! 用于扩增 !"#% (O 同源臂，上游和下游引物中分别加入 %/04!和 5/6!酶切位点； 引物 QP 和 Q- 用于扩增 !"#% PO 同源臂，上游和下游引物中分 别加入 7’4N"和 9!+!酶切位点。引物 <# 和 载体，验证正确后命名为 ,<.Z5D。同时，采用全菌 图 # 2CN 系统用于微生物基因敲除的基本步骤 葛堂栋等：痢疾杆菌酸抗性系统相关基因缺失突变体的构建 -&T 生 物 技 术 通 讯 !"##"$% &’ (&)#"*+’)!),- ./0123 ’/14 %5617 8994 :*$ 的方法扩增出待敲除基因的上下游同源臂。其中，上游同源 臂 4; 端带有 !"#+!酶切位点，<; 端为 $"%!酶切位点；下游同 源臂 4;端带有 &’(="酶切位点，<;端为 )*+!酶切位点。将上下 游同源臂 :*$ 产物连接到 6>?2@A# 载体，测序正确后，再将其 以相应的酶切后，分步连接到 6"#BCD 载体上。经酶切验证并测 序正确后，用 !"#+!和 )*+!双酶切，经胶回收试剂盒回收，便 可获得两侧同源臂为 499E@99 F6 的线性打靶 ?’G（图 8）。以回 收片段为模板，:*$ 扩增出打靶基因，再次以胶回收试剂盒回 收，便可以很容易地获得浓度高达 <99 DH I#!的线性打靶 ?’G 片段；而且因为回收后的片段纯度很高，几乎不存在由于质粒模 板本身具有筛选重组子的抗药性基因而带来的假阳性，从而使 阳性克隆的比例大大增加。 818 痢疾杆菌 8J4K#缺失突变体的构建 将 8J4K# I 6L?J3 制备成电击感受态，线性打靶 ?’G 在 299 DH I M!E8 #H I M!范围内取不同的浓度进行电击转化，在卡那霉 素抗性的 !( 平板上筛选阳性克隆并经 :*$ 验证，将得到的阳 性转化子于 J8N培养 28 O 以上，以去除 6L?J3 质粒。 由于线性 ?’G 片段的转化效率比质粒转化低得多，为提高 电击转化效率，必须制备高效的感受态细胞。我们在实验中发现 将 8J4K# I 6L?J3 培养至 ,399DM为 914E913 时效果最好。同时，对 !A阿拉伯糖的加入时间也进行了，发现在孵育终止前 2 O 加入 !A阿拉伯糖至终浓度为 2 MM/0 I ! 或终止前 <9 MPD 加入 !A阿拉伯糖至终浓度为 8 MM/0 I !均可取得较好的效果。此外， 我们对电击用线性打靶 ?’G 的用量也进行了尝试，发现其终浓 度不应低于 899 DH I M!，但转化效率并不随浓度的增加而有明 显的提高，在实际操作中我们将终浓度控制在 <99E499 DH I M!。 由于突变体较之野生株而言生长一般变缓，为获得较多的 阳性转化子，我们将电击后在无抗生素选择压力的培养基中培 养的时间延长至 214E< O。根据我们的经验，在涂板培养 8J O 左 右看到的多为阳性转化子，太早或太晚长出的多为杂菌或野生 株，除了操作可能引起的污染外，也可能是由于线性 ?’G 携带 供筛选用抗药性基因及其启动子，从而在电击转化后抗药性基 因得以瞬时表达的缘故。 实验过程中，我们对 *-./、*-.!、0*’1 和 0*’2等 J 个基因进 行尝试，发现每 <99 DH 线性 ?’G 片段可以产生 4E899 个转化 子，其中阳性重组率均达到 Q9R以上。 81< 痢疾杆菌 8J4K#缺失突变体卡那霉素抗性基因的去除与验证 质粒 6*:89 表达的 S!:重组酶能够识别卡那霉素抗性基因 两侧 ：>CTB5T 图 < *-./ 基因缺失突变体的 :*$验证 >：>CTB5T；2：8J4K#；8：8J4K#（*-./ VV3"(）；<：8J4K#$*-./ 图 J *-.! 基因缺失突变体的 :*$验证 >：>CTB5T；2：8J4K#；8：8J4K#（*-.!VV3"(）；<：8J4K#$*-.! 图 4 0*’1 基因缺失突变体的 :*$验证 >：>CTB5T；2：8J4K#；8：8J4K#（0*’1VV3"(）；<：8J4K#$0*’1 图 3 0*’2基因缺失突变体的 :*$验证 >：>CTB5T；2：8J4K#；8：8J4K#（0*’2VV3"(）；<：8J4K# JQ9 ! 讨论 在病原微生物研究中，基因的缺失或置换是确定基因未知 功能、阐明致病机理的重要手段。传统的方法大多依赖于大肠杆 菌本身的重组系统，但重组效率低，筛选困难。"#$%& 等发现 ’$( 噬菌体的 ’)(*+ 系统可以介导线性片段与染色体的同源重组， 同源臂仅为 ,- ./0-12。相比之下，! 噬菌体 ’)3 系统重组效率要 更高一些。构建携带 !噬菌体 ’)3 系统的宿主菌有 - 种方法：一 种是将编码 ! 噬菌体 ’)3 系统的基因整合到大肠杆菌染色体 上，其表达受温度敏感的 (4567 抑制子严格控制 082；另一种则是将 其克隆到温度敏感型低拷贝质粒 0992。后一种方法由于质粒的灵活 性，可以更方便地应用于不同的菌株；另外，通过提高温度可以 很容易地将质粒去除，从而使获得的突变体背景清晰，便于进一 步的研究。但如果宿主菌自身的质粒也携带相同的复制子，这种 方法则难以奏效。 目前，大多数人认为利用 ’)3 重组系统进行基因敲除的优 越之处在于所用同源臂可以短至 !1:61 ./，因此可以用 ;<’ 的 方法一步获得线性打靶 =>?，不必依赖于酶切连接等传统的基 因工程手段。但实际情况并非如此。由于多数细菌感受态细胞的 转化效率都要比大肠杆菌低得多，而且线性 =>? 片段的转化效 率一般只有质粒转化效率得 9 @ 9111:9 @ 91，因此认为利用 ’)3 重 组系统可以在大肠杆菌以外的微生物中很容易地进行基因敲除 的观点很值得商榷。尽管如此，与传统的依赖于 ’)(? 的同源重 组相比，’)3 系统的重组效率要高得多，而且由于线性 =>? 片段 本身无法在细胞内存活，以前转化子中难以筛选到阳性克隆的 问题迎刃而解，因此探讨可以使该系统更好地用于基因敲除研 究的方法是非常有必要的。本室王恒睴等曾利用该系统在痢疾 杆菌敲除过 !"# 和 !$%& 等 - 个基因，但重组效率较低 099A9-2。究其 原因，除了感受态细胞的转化效率相对偏低以外，很可能是痢疾 杆菌中 ’)3 重组系统中的 B$C 蛋白未能有效地抑制具有外切 核酸酶"活性的 ’)(D<= 蛋白的缘故。将同源臂延长至 611: 511 ./，我们很容易地敲除了 ’#(& 等 , 个基因，并且每 !11 %& 线性 =>? 片段可以产生 6:-11 个转化子，其中阳性重组率均达 到 81E以上，说明延长同源臂的长度可以明显提高重组效率。尽 管这种做法使得操作相对烦琐，但我们认为通过增加实验步骤 来换取成功率的提高是完全值得的。事实上，从获得突变体所需 时间的角度来看，实验速度不是减慢而是加快了。 在大肠杆菌中，’#(&、’#()、*’+,、*’+-、.!#& 均处于染色体 上 ! F61:! FF6G- H. 的一段区域，痢疾杆菌中也极其类似。由于 它们都和耐酸特性密切相关，I$(H)J 等将其称之为 “适应岛（KLMN %)OO LOP$%3）”0-92。进一步的研究表明，在酸性环境中 ’#(& 可能与 ’#() 形成异源二聚体并发挥类似于分子伴侣的功能 0--2。*’+, 和 *’+-编码的蛋白均属于 QRS’ 家族，其中 T#L* 被认为是很多酸 应答基因的正向调控子，T#LU 在酸性环境中表达量上调，但其功 能尚不清楚0-!2。通过等酸诱导基因缺失突变体的构建，结合功能 基因组学中其他研究方法，我们期待可以发现更多的酸抗性基 因，为 B=?’ 系统调控网络的组成及应答机制等研究带来新的 突破。 参考文献 092 V$M)JC$% W’A WC$PP ;QG 43)%MLKL($MLX% XK OL&C$ WY3)/)%3)%M &)%)O $OOX(L$M)3 ZLM# M#) OM$MLX%$J[ Y/#$O) $(L3 YJ)OLOM$%() /#)%XM[/) XK W#L&)PP$ KP)S%)JL0\2G ]XP ]L(JX.LXPA 988FA-9^8-6 0-2 <$OM$%L)YA<#RJ(# B]G ’)&RP$MXJ[ %)MZXJH XK $(L3 J)OLOM$%() &)%)O L% ,"1’(2+1’+! 13$+0\2G ]XP ]L(JX.LXPA -11!A,5^F88 062 +R(H)J =QA +R(H)J >A W0\2G ]XP ]L(JX.LXPA -119A,1^-1 072 $MP ?($3 W(L bW?A -111A87c99d^6875 0912 ]RJ/#[ _$MP ?($3 W(L bW?A -111A87^FF,1 09-2 ]RJ/#[ _<，<$C/)PPX%) _BG Q$C.3$ ’)3YC)3L$M)3 J)(XC.L%X&)%L( )%&L%))JL%& XK )%M)JX#)CXJJ#$&L( $%3 )%M)JX/$M#X&)%L( ,013$+ 0\2G D]< ]XP DLXPXA -11!A,^99 09!2 QLMMP) \VG ?% )SX%R(P)$O) L%3R()3 .[ .$(M)JLX/#$&) !G 44G >$MRJ) XK M#) )%‘[CL( J)$(MLX%0\2G DLXP <#)CA 98F7A-,-^F78 09,2 QL "A _$J$HXROLO BA <#LR W_A (/ !$0 +#) .)M$ /JXM)L% XK /#$&) P$C.3$ /JXCXM)O OMJ$%3 )S(#$%&)0\2G ]XP DLXPA 9885A-7F^7!! 0962 ]RJ/#[ _? 0\2G +J)%3O DLX(#)C W(LA -119A-Fc6d^!-6 0-12 "#$%& TA DR(#XP‘ UA ]R[)JO \;A (/ !$0 ? %)Z PX&L( KXJ =>? )%N &L%))JL%& ROL%& J)(XC.L%$MLX% L% ,"1’(2+1’+! 13$+ 0\2G >$M B)%)MA 9885A-1^9-! 0-92 I$(H)J \A <$J%L)P *G *(XPX&L($P KLM%)OOA &)%XCL( LOP$%3O $%3 .$(M)N JL$P /$M#X&)%L(LM[G ? =$JZL%L$% aL)Z XK M#) )aXPRMLX% XK CL(JX.)O 0\2G *]De ’)/A -119A-9^!7F 0--2 IXCC$LO UA _JL% *A