GB 29685-2013 动物性食品中林可霉素、克林霉素...多残留的测定

ICS G 中华人民共和国国家 GB 29685—2013 食品安全国家标准 动物性食品中林可霉素、克林霉素和大观 霉素多残留的测定 气相色谱—质谱法 Determination of Lincomycin, Clindamycin and Spectinomycin residues in animal derived food by Gas Chromatography Mass Spectrometric method 2013-09-16发布 2014-01-01实施 中华人民共和国农业部 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 I 目 次 目 次 ......................................................................... I 前 言 ........................................................................ II 动物性食品中林可霉素、克林霉素和大观霉素多残留的测定 气相色谱-质谱法 ........... １ 1.范围 ......................................................................... １ 2 性引用文件 .............................................................. １ 3 原理 ........................................................................ １ 4 试剂和材料 ................................................................... １ 5 仪器和设备 .................................................................. ２ 6 试料的制备与保存 ............................................................ ２ 6.1 试料的制备 ................................................................. ２ 6.2 试料的保存 ................................................................. ３ 7 测定步骤 .................................................................... ３ 7.1 标准曲线的制备 ............................................................. ３ 7.2 提取 ....................................................................... ３ 7.3 净化 ....................................................................... ３ 7.4 测定 ....................................................................... ４ 7.5 空白实验 ................................................................... ５ 8 结果计算与表述 .............................................................. ５ 9 方法灵敏度、准确度、精密度 .............................................. ５ 9.1 灵敏度 ..................................................................... ５ 9.2 准确度 ..................................................................... ５ 9.3 精密度 ..................................................................... ６ 附录 A ........................................................................ ７ II 前 言 本标准的附录 A 为资料性附录。 本标准系国内首次发布的国家标准。 １ 动物性食品中林可霉素、克林霉素和大观霉素多残留的测定 气相色谱—质谱法 1.范围 本标准规定了动物性食品中林可霉素、克林霉素和大观霉素残留量检测的制样和气相色谱-质谱测 定方法。 本标准适用于猪、牛和鸡的肌肉和肾脏以及牛奶和鸡蛋中林可霉素、克林霉素和大观霉素单个或 多个药物残留量的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方 研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试料中残留的林可霉素、克林霉素和大观霉素，用磷酸缓冲液提取，3％三氯乙酸沉淀蛋白，离子 对原理反相 SPE 柱净化，N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺衍生，气相色谱-质谱法测定，外标法 定量。 4试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 盐酸林可霉素标准品：含量≥99％；盐酸克林霉素和盐酸大观霉素标准品：含量≥95％。 4.2 N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺 4.3 乙酸：优级纯。 4.4 甲醇：色谱纯。 4.5 乙睛：色谱纯。 4.6 正己烷：色谱纯。 4.7 磷酸二氢钾：优级纯。 4.8 磷酸：优级纯。 ２ 4.9 氢氧化钾：优级纯。 4.10 三氯乙酸：优级纯。 4.11 十二烷基磺酸钠：色谱纯。 4.12 HLB 固相萃取柱：60 mg/3 mL，或相当者。 4.13 提取液 ：取磷酸二氢钾 1.36 g，用水溶解并稀释至 1 000 mL，用磷酸调节 pH 至 4.0。 4.14 3％三氯乙酸溶液：取三氯乙酸 3.0 g，用水溶解并稀释至 100 mL。 4.15 2mol/L氢氧化钾溶液：取氢氧化钾 11.6 g，用水溶解并稀释至 100 mL。 4.16 十二烷基磺酸钠溶液：取十二烷基磺酸钠 2.78 g，用水溶解并稀释至 50 mL。 4.17 十二烷基磺酸钠缓冲液：取十二烷基磺酸钠 2.78 g，用水溶解，加乙酸 1 mL，用水稀释至 500 mL。 4.18 1 mg/mL 林可霉素、克林霉素和大观霉素标准贮备液：精密称取林可霉素、克林霉素和大观霉 素标准品各 10 mg，分别于 10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 1 mg/mL 的林可 霉素、克林霉素和大观霉素标准贮备液。2～8℃避光保存，有效期 6 个月。 4.19 100 µg/mL标准工作液：精密量取 1 mg/mL林可霉素、克林霉素和大观霉素标准贮备液各 1.0 mL， 分别于 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为 100 µg/mL 的林可霉素、克林霉素和大观霉 素标准工作液。2～8℃避光保存，有效期 1 周。 5 仪器和设备 5.1 气相色谱-质谱联用仪：配 EI 源。 5.2 分析天平：感量 0.000 01 g。 5.3 天平：感量 0.01 g。 5.4 冷冻高速离心机 5.5 电热恒温水浴锅 5.6 旋涡混合器 5.7 均质机 5.8 聚四氟乙烯离心管：50 mL。 6 试料的制备与保存 6.1 试料的制备 6.1.1 猪、牛和鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织 取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。 ——取均质后的供试样品，作为供试试料。 ——取均质后的空白样品，作为空白试料。 ——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。 6.1.2 牛奶和鸡蛋 ３ 取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶和鸡蛋，混合，并使均质。 ——取均质后的供试样品，作为供试试料。 ——取均质后的空白样品，作为空白试料。 ——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。 6.2 试料的保存 组织试料-20℃以下保存。鸡蛋和牛奶试料 2～8℃以下保存。 7 测定步骤 7.1 基质匹配标准曲线的制备 分别精密量取 100 µg/mL 林可霉素、克林霉素和大观霉素标准工作液适量，用甲醇稀释，配制成 浓度为 50、100、200、400、800、1 600 和 3 200 μg/L 的系列混合标准溶液，各取 1.0mL，分别溶解 经提取、净化及吹干的空白试料残余物，充分混匀，室温吹干，加 N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰 胺 500 μL 和乙腈 100 μL，涡旋混合 1 min，密封，于 75℃恒温箱衍生反应 1 h，于室温氮气吹干，加 正己烷 0.5 mL 溶解残余物，涡旋混匀，供气相色谱-质谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准 溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 7.2 提取 7.2.1肌肉和肾脏组织 称取试料（5±0.05）g，于 50 mL 聚四氟乙烯离心管中，加提取液 10 mL，振荡 5 min，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液于另一离心管中，残渣中加提取液 10 mL，重复提取一次，合并两次上清液， 加 3％三氯乙酸溶液 5 mL，混匀，8 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用 2 mol/L 氢氧化钾溶液调 pH 至 5.8±0.2，加十二烷基磺酸钠溶液 2 mL，漩涡混匀，静置 15 min，备用。 7.2.2牛奶和鸡蛋组织 称取试料（5±0.05）g，于 50 mL 聚四氟乙烯离心管中，加提取液 10 mL，振荡 5 min，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液于另一离心管中，残渣中加提取液 10 mL，重复提取一次，合并两次上清液， 加正己烷 5 mL，混匀，5 000 r/min 离心 15 min，取下层液，用 2 mol/L 氢氧化钾溶液调 pH 至 5.8±0.2， 加十二烷基磺酸钠溶液 2 mL，漩涡混匀，静置 15 min，备用。 7.3 净化 HLB 柱依次用甲醇 3 mL、水 3 mL 和十二烷基磺酸钠缓冲液 3 mL 活化，取备用液过柱，用水淋 洗两次，每次 3 mL，用甲醇 4 mL 洗脱，收集洗脱液，于 40℃水浴氮气吹至近干，室温吹干，加 N,O- 双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺 500 μL 和乙腈 100 μL，涡旋混合 1 min，密封，于 75℃恒温箱衍生反 ４ 应 1 h，室温氮气吹干，用正己烷 0.5 mL 溶解残余物，涡旋混匀，供气相色谱-质谱测定。 7.4 测定 7.4.1 色谱条件 色谱柱：毛细管色谱柱 Rtx-5（5%苯基甲基聚硅氧烷），（30 m×0.25 mm），或相当者； 进样口温度：280℃； 进样方式： 不分流； 进样体积：1 μL； 模式： 恒流； 载气：氦气（99.999％）； 柱流速：1 mL/min； 柱温升温程序： 表 1 柱温升温程序 起始温度 ℃ 终止温度 ℃ 升温速率 ℃ /min 保持时间 min 总时间 min 150 150 150 300 — 20 2.0 10 2.0 19.5 7.4.2 质谱条件 离子源温度：200℃ 接口温度：280℃ 质谱采集（SIM）：林可霉素和克林霉素扫描离子：126（定量离子），127，73 大观霉素扫描离子：145（定量离子），171，187，201 7.4.3 测定法 7.4.3.1 定性测定 通过样品色谱图的保留时间与标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准品各色谱 峰的特征离子相对照定性。样品与标准品的保留时间的相对偏差不大于 5％；样品特征离子的相对丰 度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 2 的规定，则可判断样品中 存在相应的被测物。 表2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50% 20%至 50% 10%至 20% ≤10% 允许的相对偏差 ±10% ±15% ±20% ±50% 将供试试样和标准溶液的定量离子面积之比作单点校正定量。 7.4.3.2 定量测定 取试样溶液和标准溶液，按外标法，以峰面积定量，标准溶液及试样溶液中林可霉素、克林霉素和 大观霉素响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，林可霉素、克林霉素和大观 ５ 霉素标准溶液和空白添加试样溶液中特征离子质量色谱图见附录 A。 7.5 空白实验 除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。 8 结果计算与表述 单点校准： As CsA C  或基质匹配标准曲线校准：由As＝aCs＋b， 求得a和b，则 a bA C   试料中林可霉素、克林霉素和大观霉素的残留量（µg/kg），按下式计算： m CV X  式中： X——供试试料中相应的林可霉素、克林霉素或大观霉素的残留量，µg/kg； Cs——标准溶液中相应的林可霉素、克林霉素或大观霉素浓度，µg /L； C——供试试料溶液中相应的林可霉素、克林霉素或大观霉素浓度，µg /L； As——标准溶液中相应的林可霉素、克林霉素或大观霉素的衍生物的峰面积； A——供试试料溶液中相应的林可霉素、克林霉素或大观霉素的衍生物的峰面积； V——溶解残余物体积，mL； m ——供试试料质量，g。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 检测方法灵敏度、准确度、精密度 9.1灵敏度 本方法的检测限，林可霉素和克林霉素为 15 µg/kg，大观霉素为 25 µg/kg。 本方法林可霉素和克林霉素在肌肉、牛奶和鸡蛋中的定量限为 20 µg/kg，在肾脏中定量限为 50 µg/kg；大观霉素的定量限为 50 µg/kg。 9.2准确度 本方法克林霉素在 20～200 μg/kg、林可霉素在 20～3 000 μg/kg 和大观霉素在 50～4 000 μg/kg 添 加浓度水平上回收率为 70%～110%。 ６ 9.3精密度 本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。 ７ 附 录 A （资料性附录） 图 A1 标准溶液衍生物离子色谱图 （林可霉素和克林霉素 100 μg/L、大观霉素 250 μg/L） 图 A2 猪肌肉组织空白试样离子色谱图 图 A3 猪肌肉组织空白添加林可霉素、克林霉素和大观霉素试样离子色谱图 （林可霉素和克林霉素 20 μg/kg、大观霉素 50 μg/kg）