细菌基因组

细菌基因组学 细菌基因组结构特点 　　（1）细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）。类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。 　　（2）具有操纵子结构（有关操纵子结构详见基因达的调控一章）其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。 　　（3）在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。 　　（4）和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。 　　（5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。 　　（6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。 　　（7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。 （8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。 细菌基因组学研究策略 细菌基因组的研究策略主要分为DNA 的提取及测序、基因组组装、基因组完成(Genome finishing)、基因预测、基因注释和基因组比较六大部分。 DNA 的提取及测序 首先是DNA 的提取及测序。DNA 提取时要保证DNA 纯度, 同时要避免DNA 污染。目前，主要用基因组测序有两种：1，基于第二代测序平台的策略-罗氏454+illumina测序+ABI3730：二代测序读长（reads）有限，最长的是罗氏454，现在据说能有400bp吧，illumina测序和其他测序就只能有150bp，现在测序又是将基因组打断后测序，但仍然可能测得的读长可能不够长，导致一部分信息丢失，于是产生gap，这个只要根据其上下游已测得的序列信息进行引物设计，再用一代测序补gap即可消除，因此得到细菌基因组完成图；2，基于第三代测序平台的策略：PacBio RS II平台+ illumina测序：该方法采用的数据是Illumina生成的短读序片段、Pacific Biosciences生成的长读序，即可得到0 Gap 细菌基因组完成图。 细菌基因组学是研究细菌全基因组DNA 序列及其结构与功能的学科。1995 年, 科学家获得了流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae Rd)的全基因组序列, 这是第一个完整的基因组序列, 也是第一个完成的细菌基因组序列。紧接着古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)基因组、大肠杆菌(Escherichia coli K-12)基因组等也相继完成。细菌基因组研究不仅有利于研究细菌的基本生命过程,同时也对高等真核生物的基因组学及后基因组学研究提供了参考和平台。到目前为止, NCBI 上记录了1 534 个细菌基因组, 包括了103 个古细菌和1 431个真细菌(2011-4-24), 其中中国科学家完成了44个细菌基因组的测序工作。 基因组组装 常用的软件有Newbler、AMOScmp、Phred/Phrap/Consed和Velvet等, 可以根据自己的数据选择合适的组装软件, 也可以结合多种方法获得较好的组装结果。 基因组完成(Genome finishing) 基因组完成(Genome finishing)即确定组装获得的Contigs 之间的连接顺序并修补Gaps。可以按照以下几个步骤进行: 首先, 计算Contigs 和基因组的平均Reads 覆盖度, 通过Contigs 与基因组平均Reads覆盖度的比较, 获得Unique contigs 和Repeat contigs以及Repeat contigs 的重复次数。 基因预测 常用的蛋白质编码基因预测软件有Glimmer、GeneMarkS和Prodigal,通常可以任选其中一款软件进行预测, 也可以结合多个软件以获得较好的预测结果。此外, ZCURVE是基于DNA 序列Z curve 理论的蛋白质编码基因识别软件, 具有较高的基因起始位点预测准确性;GS-Finder 是不依赖于rRNA 序列的细菌基因组翻译起始位点识别软件, 能大大提高翻译起始位点预测的准确性; OperonDB 是比较常用的操纵子预测软件, 可以用来预测共同转录的基因簇。 基因注释 这一步通常要整合多个数据库, 如NCBI 的nr 库、InterPro、COG和KEGG等, 通过序列比对进行预测基因的注释。此外, 还可以利用一些特定功能的软件或者数据库进行相应的分析, 如用SignalP预测信号肽、TMHMM预测跨膜结构、ISfinder预测插入序列、VFDB 预测毒力因子、Islander 数据库查询基因组岛、MobilomeFINDER和IslandViewer[鉴定基因组岛、PAIDB 预测潜在的致病岛、Repeat-match 预测基因组重复序列、Tandem repeat Finder寻找串联重复序列、CRISPR finder预测CRISPR 序列、Phage-finder寻找噬菌体序列、TCDB注释膜转运蛋白、Ori-Finder寻找复制起始位点、ARDB鉴定和注释抗菌素抗性基因、ACLAME注释可变遗传因子(Mobile genetic elementselements)和TADB数据库搜索Type2 toxin-antitoxin位点等。另外, 有些基因是生物体生存不可或缺的基因, 即必需基因, 它们是生命的基础。DEG数据库收集了一些物种的必需基因, 也可以用于注释必需基因, 这些必需基因是很好的抗菌药物靶基因。注释结束后, 对基因注释结果进行检查, 比如基因之间是否有Overlap、是否存在假基因等, 可以利用Mciobial Genome Submission Check程序进行检查。 基因组比较分析 获得完整基因组及其注释后, 通常会进行相近物种之间或同一物种不同株之间的基因组比较分析。常用的细菌基因组比较分析软件和数据库有ACT、Mauve、MUMmer、MicrobesOnline、mGenomeSubtractor和xBASE等。ACT (Artemis Comparison Tool), 是一款进行基因组及其注释之间比较的可视化软件, 支持多种输入格式(EMBL, GenBank, FASTA 和GFF 格式), 可以用来鉴定相似序列、插入、缺失、重排等。 细菌基因组学研究成果 1，极端嗜酸甲烷氧化细菌的基因组研究 需 氧 甲 烷 氧 化 细 菌 (Methylacidiphilum infer-norum)可以利用那些从来源地的土壤和基质中释放出来的甲烷. 这些细菌作为一个生物滤膜可减少甲烷向大气的排放, 因此它们为人类与全球温室效应的斗争提供了一种有效策略. 原先已知的甲烷氧化细菌都无法在 pH 5 以下生长, 然而一些有活跃甲烷循环的环境是非常酸性的. 研究人员从新西兰地狱门的地热区域中分离得到一株嗜酸的甲烷氧化细菌V4, 这株细菌的最适生长温度在 pH 2.0~2.5 之间. 与已知的甲烷氧化细菌不同, 它并不属于变形菌门, 而属于疣微菌门(Verrucomicrobia). 与之相似的细菌也在意大利和俄罗斯的地热系统中被独立地分离得到.疣微菌是一类广泛分布但是却被很少研究的细菌世系. 虽然不依赖培养的方法发现这个门的细菌 在环境中广泛分布, 在包括土壤、海水、温泉和人类胃肠道中都有发现, 但是其中只有很少的一部分在培养中被分离得到.南开大学泰达生物技术学院王磊教授课题组、新西兰 GNS 极端微生物研究组和夏威夷大学 Alam 教授课题组合作破译得到了 V4 菌的全基因组序列. V4基因组是疣微菌门第一个被破译的基因组. V4 菌株最初被定名为 Methylokorus infernorum(后来改为Methylacidiphilum infernorum), 是一株自养细菌. M.infernorum 的基因组大小约 2.3 Mbp, 只编码简单的信号传导途径, 调控少数基因的表达, 使整个基因组的运作呈流水线式.甲烷氧化细菌利用甲烷单加氧酶来将甲烷转化为甲醇, 甲醇随后可以氧化为甲醛、甲酸和 CO2. 研究者在 M. infernorum 基因组中发现了编码甲烷单加氧酶的基因, 这些基因与在变形菌门中甲烷氧化菌的甲烷单加氧酶有同源性. 对 M. infernorum 的 3 个pmoA 基因(编码颗粒状甲烷单加氧酶)的遗传学分析将它们归入一个与变形菌门中同源基因不同的进化分支中. 这显示疣微菌门和变形菌门的甲烷氧化菌的分离时间很古老, 甲烷氧化能力并不是由近期的基因横向转移获得的. 这一发现显示细菌中的甲烷氧化菌比原先估计具有更加广泛的遗传背景.M. infernorum 的核心代谢系统被几乎完整的重构, 并且发现与其他甲烷利用细菌相比, 该菌的自养核心代谢途径有密切相互作用, 那些原先已知的甲醇和甲醛氧化途径也都不完整或者不存在, 这显示M. infernorum 使用了全新的甲烷氧化途径. M. infer-norum 基因组并没有编码微管蛋白 (在 Prostheco-bacter 属中发现)或者其他真核特征的蛋白.核糖体蛋白和 RNA 聚合酶亚基的遗传分析明确地将 Planctomycetes, Verrucomicrobia 和 Chlamydiae3个门归入一个单独的进化分支, 称为 PVC 超门, 然而这 3 个门中基因组的基因组成情况却有巨大的差异. 比较基因组学分析显示 M. infernorum 世系的进化涉及与大量细菌的广泛横向基因转移. M. infer-norum 基因组显示出包括蛋白质整体等电点升高等对极端酸性环境的适应性.M. infernorum 的测序揭开了疣微菌门这一广泛分布且多样的细菌门的面纱. 对其分析发现了全新的甲烷利用途径, 并且证明了在极端酸性环境中甲烷氧化细菌的多样性, 为人类研究和控制地球温室效应的产生提供了新的理论基础.该研究成果分别在 2007 年和 2008 年发表于Nature 和 Biology Direct 2，重要采油细菌的基因组破译和重油降解分子机制的研究 针对一株分离自我国大港油田的、具有较强长链烷烃降解能力的细菌进行基因组测序，我国学者破译了嗜热采油细菌的全基因组序列，并在世界上首次揭示了重油主要组分-长链烷烃的微生物降解途径，获得了具有重要应用价值的生物酶。项目成果于2007年3月发表在国际权威学术期刊《美国国家科学院院刊》（PNAS）上，并于同年12月被教育部评选为“2007年中国高校十大科技进展”。 细菌基因组学研究挑战 虽然第二代测序技术给细菌基因组学研究带来了新的机遇, 但是也带来了一些新的问题, 比如罗氏454 测序系统常在单碱基重复序列区域出现插入/缺失, 会导致注释基因的移码突变;Solexa 测序法获得的Reads 长度较短而影响拼接结果; 细菌基因组组装及分析较繁琐, 亟待新的方法或高度整合型的处理流程来加快分析过程等。