表达h_2m_A24单链的RMA_S细胞系的构建及鉴定

免疫学杂志 2010年 8月 第 26卷 第 8期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 26 No. 8 Aug. 2010 HLAⅠ类分子由重链、轻链（β2微球蛋白)组成, 广泛分布各种有核细胞面，并按一定方式将重链 和轻链转运入内质网腔。其基本生物学功能是将内 源性抗原肽递呈给 T 细胞上的 T 细胞抗原受体 （TCR）识别。CD8+ T细胞识别抗原表位的能力受到 特定 MHC-I类分子限制。HLA-A2是人群中最普遍 的 HLA-A等位基因, 在我国有超过 50%的人表达 HLA-A2[1-2]。HLA-A2阳性的 T-B杂交瘤细胞系 T2 细胞已被广泛应用于 A2表位的筛选[1,3]。HLA-A24 在中国人群中占 32.9%，是东方人群中分布最广的 HLA-A等位基因之一[4]，但目前国内还没有建立表 达 A24的细胞系。 RMA-S 细胞系来源于 RBL-5 小鼠淋巴瘤细 胞，其抗原处理相关转运蛋白(transporter associated with antigen processing，TAP) 的亚单位 TAP-2基因 表达缺陷。TAP负责内源性多肽从胞浆到内质网的 转运, TAP分子缺陷，则内源性多肽无法到达内质 网腔与 MHCⅠ类分子结合，导致 MHCⅠ类分子向 细胞表面转运缺陷，不能在细胞表面稳定表达 [5-6]。 将 HLA-A24 基因（hβ2m-A24）转染到 TAP分子缺 陷的小鼠 RMA-S细胞中，构建成 RMA-S-A24 细 胞系后，hβ2m-A24分子在该细胞系表面不能稳定 表达，而加入 HLA-A24 特异性外源性多肽可以 稳定 MHC I 类分子的表达 [5]。通常，采取共转染 的方式将重链和轻链同时转入细胞中建立所需 要的细胞系 [7]。但共转染两个质粒通常转染效率 较低，在本研究中，我们首次将 HLA-A24 分子的 重链和轻链连接到一个真核表达载体上，在 HLA-A24 分子上连接 A2TM 跨膜蛋白，构建了 pcDNA3.1/hβ2m-A24-A2TM 质粒及 RMA-S-A24 细胞系。本研究为深入研究 HLA-A24人群中多种 疾病的细胞免疫、筛选和鉴定合适的 T 细胞抗原 表位奠定了基础。 基金项目：南京市卫生局重大项目（ZKX08020）, 南京市医学科技发 展重大项目（2007年第 18号） 作者单位：210003，南京市疾病预防控制中心 * 通信作者： 丁 洁，Tel ：025-83538352; E-mail：yu2an2002@yahoo. com.cn △共同第一作者 ·论 著· [文章编号]1000-8861（2010）08-0717-05 表达 hβ2m-A24单链的 RMA-S细胞系的构建及鉴定 王 燕，程婷婷△，陈晓蔚，丁 洁 * [摘 要] 目的 构建人类白细胞抗原 HLA-A24真核表达载体,并使其在小鼠细胞 RMA-S获得稳定表达。方法 采用 PCR方 法扩增出 HLA-A24基因的重链，将其克隆到含轻链 β2m的真核表达载体 pcDNA3.1上,构建成表达完整 HLA-24分子的真核 表达载体。用限制性内切酶酶切分析和 DNA序列分析鉴定重组质粒，电转染 RMA-S细胞，药物筛选稳定细胞系。蛋白印迹法和 流式细胞鉴定 HLA-A24分子在靶细胞表面的表达。结果 成功构建了 pcDNA3.1/A24 真核表达载体, 并使 LA-A24 分子在 HLA-A24阴性的小鼠 RMA-S细胞表面获得稳定表达。结论 真核表达载体成功构建和稳定转染 RMA-S细胞系的建立为进一 步研究 HLA-A24人群中多种疾病的细胞免疫、筛选和鉴定合适的 T细胞抗原表位奠定了基础。 [关键词] HLA-A24；PCR；真核表达载体；hβ2m-A24-A2TM；RMA-S-A24细胞系 [中图分类号] R392.11 [文献标识码]A Construction and identification of hβ2m-A24 single chain expressing cell line WANGYan, CHENGTingting, CHENGXiaowei, DING Jie Nanjing Center for Disease Prevention and Control, Nangjing 210003, China [Abstract] We aim to construct HLA-A24 eukaryotic expression vector and obtain stable expression on TAP-deficient RMA-S cells of HLA-A24 negative mouse. PCR technique was employed to amplify A24 gene, which was subsequently subcloned into vector pcDNA3.1(+) for construct a eukaryotic expression namely pcDNA3.1(+)/A24. Then, the recombinant plasmid was identified by restric－ tion analysis and sequence analysis, and transferred into the target cells. The surface expression of linked chainβ2m-A24 was as－ sessed by Western blot and flow cytometry. The results showed that HLA-A24 molecules were successfully expressed on RMA-S cells transfected with pcDNA3.1(+)/A24. The construction of the eukaryotic expression vectors and the establishment of stable transfected RMA-S cell lines provide a solid foundation for further experimental studies on the function of HLA-A24genes. [Key words] HLA-A24; PCR; Eukaryotic expression vector; hβ2m-A24-A2TM; RMA-S-A24 line 717· · 免疫学杂志 2010年 8月 第 26卷 第 8期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 26 No. 8 Aug. 2010 1 与方法 1.1菌种与质粒 真核表达载体 pEF-A2TM、真核表 达载体 pcDNA3.1/ hβ2m-A2、含 HLA-A24重链基 因的原核质粒、大肠杆菌 DH5α由中国科学院微生 物研究所高斌研究员惠赠。 1.2 仪器与试剂 microporator（MP100）电转仪（Na－ noEnTek Inc）；蛋白质转印系统(Bio Rad公司)；高保 真 Taq酶、限制性内切酶 AvaⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶购自 Fermentas 公司；STAR HS DNA poly－ merase购自宝生物公司；质粒提取和 DNA凝胶回收 试剂盒购自博大泰克；PEI 试剂购自 Sigma 公司； Zeocin购自 Invitrogen；山羊抗小鼠 HRP标二抗为 Santa Cruz 公司产品；小鼠抗人 β2m 单克隆抗体 L369为 Epigen公司产品。其它常规化学试剂均为 分析纯以上产品。 1.3 PCR引物设计与合成 引物由 invitrogen公司 合成。在 PCR特异的引物两端分别加入相应的酶切 位点和保护碱基。所用的引物有： A24-F(Sda I ): 5′- ATCGCCTGCAGGATGGGATCTC ATTCTATGCGGTATTTCTC- 3′;A24-R(BamH I): 5′- ATCGGGATCCCGGCTCCCATCTCAGG-3′;A24-F(A－ va I): 3′-ATCGCTCGGGTATGGGATCTCATTCTATG CGGTATTTCTC- 3′；A2TM-R(Hind Ⅲ): 5′- ATCGA AGCTTCTATTTTCTATCTGAGCTCTTCC -3′ ;A24 -F (Hind III): 5′- ATCGAAGCTTATGGGATCTCATTCT ATGCGGTATTTCTC- 3′; Linker-R: 5′-ATCGTCCCG AGCCACCTCCGCC- 3′;β2m-F: 5′- ATCGATGTCT CGCTCCGTGGCCTT-3′。 1.4 HLA-24真核表达载体构建 ①HLA-A24重链 基因的原核质粒为，用引物 A24-F（Sda I）及引 物 A24-R（BamH I）进行扩增，反应条件为 94 ℃预 变性 5 min,变性、退火、延伸的条件分别是 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 90 s。经过 30个循环后, 72 ℃ 5 min。产物切胶纯化后用 Sda I和 BamH I进行双酶 切，PEF-A2TM载体以 Pst I和 BamH I进行双酶切。 Pst I和 Sad I为同尾酶。在 T4连接酶作用下, 22 ℃ 连接 1 h,转化 DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜。菌 落 PCR鉴定得到大小相符的片段后，将含目的片段 的质粒 DNA 送公司测序正确。②以 PEF-A24- A2TM为模板，用 A24-F-Aval、A2TM-R-Hind Ⅲ为 上下游引物行 PCR扩增, 扩增出 A24-A2TM产物。 得到的 PCR产物纯化后用 AvaⅠ和 HindⅢ酶切，连 接于真核表达载体 pcDNA3.1/ hβ2m-A2，操作步骤 同上。将载体上的 A2 置换为 A24-A2TM。得到 pcDNA3.1/ hβ2m -A24 -A2TM-1。③以 pcDNA3.1/ hβ2m-A24-1 为模板，STAR HS DNA polymerase 为 聚合酶，用 A24-F(Hind Ⅲ)为上游引物，Linker-R为 下游引物。反应条件为 98 ℃10 s,68 ℃ 7 min, 30个循 环。将得到的 PCR产物纯化后,在 20μl连接体系中 连接进行平末端连接（含 15 μl PCR纯化产物、2 μl 10×ligation buffer, 2 μl PEG4000，1 μl T4 连接酶）。 常规转化。随机挑取阳性菌落用菌落 PCR鉴定。得到 pcDNA3.1/ hβ2m-A24-A2TM。即所需要的目的克隆。 1.5 细胞系 K41细胞为小鼠纤维母细胞系；K42细 胞为抗原递呈分子钙网蛋白(calreticulin, CRT)缺陷 的 K41细胞；RMA-S 细胞为 TAP缺陷的小鼠淋巴 瘤细胞系。上述细胞均由中国科学院微生物研究所 高斌研究员惠赠。 1.6 细胞转染与稳定转染克隆的筛选 K41 细胞的 转染及瞬时表达。将处于对数期的 K41细胞接种于 6 孔培养板，在单层细胞上加入适量 PEI- pcD－ NA3.1/ hβ2m-A24-A2TM 混合物,轻轻混匀,置 CO2 培养箱培养 6 h后换液。继续培养至 48 h,用 West－ ern blot检测 hβ2m-A24的瞬时表达。转染后 48 h 加入 Zeocin (浓度为 100 μg/ml)选择培养基, 加压筛 选 14 d后, 筛选得到阳性细胞克隆。扩增培养即为 稳定表达 hβ2m-A24-A2TM 基因的 K41 细胞 , 命 名为 K41/hβ2m -A24 -A2TM 细胞。电穿孔转染 RMA-S细胞。取 200万对数生长期的 RMA-S细胞 置于 10 μl不含牛血清的 1640培养液中，取 2 μg pcDNA3.1/ hβ2m-A24-A2TM质粒，在 1 080 V, 50 ms的条件下进行电转。电转后 48 h加入 Zeocin (浓 度为 100 μg/ml) 选择培养基, 加压筛选 14～21 d后, 筛选得到阳性细胞克隆。扩增培养即为稳定表达 hβ2m-A24- A2TM 基因的 RMA-S 细胞 , 命名为 RMA-S/hβ2m-A24-A2TM细胞。 1.7 Western blot检测 收集转染细胞, 用含 NP40 的裂解缓冲液裂解后取适量处理后的蛋白样品进行 SDS PAGE, 取出凝胶置于硝酸纤维膜上, 蛋白质转 印系统在转移缓冲液中进行转印 (20 V, 30 min), 用 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h, PBS洗膜 2×10 min。用抗 人 beta 2m (L369)作为一抗(1 ∶1500), 4 ℃过夜, 第 2天取出 NC膜, PBS洗膜 3×10 min,以羊抗小鼠 lgG HRP(1 ∶2 000)作为二抗室温 1 h, 用 PBST 洗膜 4×10 min, 然后 PBS洗膜 2×10 min。最后暗室显影。 观察特异性条带。 2 结果 2.1 PEF-A24-A2TM 克隆的构建 A24 重链基因 718· · 免疫学杂志 2010年 8月 第 26卷 第 8期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 26 No. 8 Aug. 2010 1) PCR product of A24; 2) marker. 图 1 PCR 扩增 A24基因序列 Fig 1 Amplification of A24 by PCR 1) PCR product of A24- A2TM; 2) marker. 图 2 PCR 扩增 A24-A2TM基因序列 Fig 2 Amplification of A24-A2TM by PCR 1-5) PCR product of hβ2m- A24- A2TM- 1; 6) marker. 图 3 PCR 扩增 hβ2m-A24-A2TM-1序列 Fig 3 Amplification of hβ2m-A24-A2TM-1 by PCR 1-9) PCR product of hβ2m- A24- A2TM; 10) marker. 图 4 PCR 扩增 hβ2m-A24-A2TM序列 Fig 4 Amplification of hβ2m-A24-A2TM by PCR 1) marker 2,3) hβ2m- A24- A2TMdigested byNhe I and HindⅢ. 图 5 重组质粒的酶切鉴定 Fig 5 Identification of hβ2m-A24-A2TM by restriction enzyme digestion analysis 的 PCR扩增见图 1，以 A24-F和 A24-R为引物，可 见一约 800 bp左右的条带，大小与理论预期值相符 (831 bp)。将 A24重链基因插入 PEF-A2TM载体后， 分别以 A24-F和 A2TM-R为上、下游引物，扩增 A24-A2TM片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，可见一约 1 000 bp左右的条带，大小与理论预期相符（1 035 bp），见图 2。测序后与 EMBL-EBI 上的序列完全 一致。 2.2 pcDNA3.1/ hβ2m-A24-A2TM-1克隆构建 将 真核表达载体上的 A2 用 A24-A2TM 置换后，用 A24-F(Ava I)和 A2TM-R(Hind Ⅲ)分别为上、下游引 物进行 PCR 扩增进行鉴定,所扩增出产物条带约为 1 000 bp , 与预期的 1 035 bp目的片段相符，推断 A24-A2TM已成功插入载体；然而分别用 β2m-F和 A2TM-R(Hind Ⅲ)为上、下游引物进行 PCR鉴定，所 得的片段大于预计的 1 425 bp片段，接近 2 kb。见 图 3。将该克隆测序后发现 β2m 后面的连接桥和 A24之间多了一段 492 bp片段，片段来源不明。因 此下一步将这段片段切除。 2.3 pcDNA3.1/ hβ2m-A24-A2TM克隆构建 设计 克隆策略，采用环向扩增的方法，在这段不明来源 492 bp片段上、下游设计引物，即 A24-F(Hind Ⅲ)和 Linker-R，沿目的序列环向扩增,然后进行平末端连 接。转化后得到 9 个克隆，均分别以 β2m-F 和 A2TM-R(Hind Ⅲ)为上、下游引物进行 PCR鉴定，见 图 4。9个克隆中有 6个克隆序列大小约在 1 500 bp， 与预期的 1 425 bp片段相符。酶切后也得到了预期 的 357 bp的 β2m片段和 1 035 bp的 A24-A2TM片 段。见图 5。挑选其中 2个克隆测序，β2m-连接桥- A24的测序结果与预测的基因序列完全一致，表明 成功构建了 β2m-A24单链真核表达载体。 2.4 重组质粒转染 K41 细胞和 RMA-S 细胞表达 分析 2.4.1质粒在 K41细胞中的瞬转表达 将构建的真核 表达载体转染入 K41细胞后，48 h检测蛋白在 K41 1 000 750 1 2 bp 1 000 750 1 2 bp 2 1 1 2 3 4 5 6 kb 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kb 5000 1000 500 250 1 2 3 bp 719· · 免疫学杂志 2010年 8月 第 26卷 第 8期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 26 No. 8 Aug. 2010 1) fusion protein of hβ2m- A24- A2TM; 2) marker. 图 6 hβ2m-A24-A2TM融合蛋白 Fig 6 Fusion protein of hβ2m-A24-A2TM 1) marker; 2) fusion protein of hβ2m- A24- A2TM. 图 7 hβ2m-A24-A2TM融合蛋白 Fig 7 Fusion protein of hβ2m-A24-A2TM 1 2 Mr/103 55 000 43 000 26 000 17 000 10 000 Mr 1 2 细胞中的瞬时表达，结果显示在 Mr为 55 000左右 处有一明显的蛋白印迹条带，蛋白相对分子质量与 预期值相符（图 6）。而未转染该质粒的 K41细胞系 不见此条带。证实该质粒在 K41细胞中能较好地瞬 时表达。 2.4.2 RMA-S/hβ2m-A24-A2TM 细胞系的建立 用 Zeocin筛选转染入该质粒的 RMA-S细胞系，加压选 择后得到稳定表达 hβ2m-A24-A2TM的 RMA-S细 胞系。结果显示在 Mr为 55 000左右处有一明显的 蛋白印迹条带，蛋白相对分子质量与预期值相符（图 7）。而未转染该质粒的 RMA-S细胞系不见此条带。 证实该质粒在 RMA-S 细胞中能较好地表达。 3 讨论 T细胞表位是指在特异性免疫应答中，抗原经抗 原递呈细胞处理后，由 MHC分子向 T细胞表面抗 原受体(TCR)递呈的肽段。T淋巴细胞对表位的识 别，在特异性免疫应答的启动和调节中发挥重要的 作用。MHC I类分子主要递呈抗原提呈细胞（APC） 内部的抗原肽，这些 I类分子和抗原肽的复合物运 送到抗原递呈细胞表面后，主要递呈给细胞毒性 T 细胞，在细胞表面的 CD8分子的协同之下被 TCR 识别。T细胞表位的筛选主要有表位预测、抗原肽 亲和力分析、结合试验、抗原肽刺激 T 细胞激活实 验等[8-9]。 在抗原肽亲和性实验中，比较常用的是 T2细 胞。T2细胞是 HLA-A2阳性的 T-B杂交瘤细胞系， 由于 TAP分子缺陷，该细胞不能加工内源性的抗 原，在无抗原肽存在的情况下,其细胞表面 HLA-A2 分子的表达不稳定。当 T2细胞表面的 HLA-A2分 子与抗原肽结合后, 其细胞表面 HLA-A2的表达明 显增强 , 所以利用其与目的肽的结合程度来测定 HLA-A2分子与目的肽表位间的亲和力。而对于其 它人类 MHC-I类分子与目的肽的亲和力检测，需要 构建表达相应的人 MHC-I类分子、不表达其它的人 MHC-I类分子、且抗原递呈伴随分子（通常是 TAP） 缺陷的细胞系。人淋巴细胞系 721.174 及 TAP 缺 陷的小鼠淋巴瘤 RMA-S 细胞系是比较常用的细 胞系[10-11]。然而 721.174仍有一些内源性 HLA分子 的表达[10]。 在本研究中，我们首次了构建表达 hβ2m-A24 单链的 RMA-S细胞系。首先，我们将 A24重链基因 与 A2TM跨膜蛋白连接。A2TM是表达 MHCI类分 子 A2 重链跨膜(transmembrane domain of HLA-A2， A2TM) 的简写。本研究所用 A2TM 跨膜蛋白位于 HLA-A2的 293~343 位,含有 51个氨基酸残基,其包 括 HLA-A2 基因型的 α链的一部分 α3 区、跨膜区 和胞内区的一部分[12]。将目的蛋白与跨膜蛋白基因 相连，在跨膜蛋白的作用下可表达于细胞表面[12]。其 次，我们将 hβ2m-A2真核载体上的 A2置换为 A24 基因，由于在连接桥上选择了 Ava I酶切位点，连接 后载体上 β2m和 A24重链之间的连接桥由原来的 19个氨基酸变为 11个氨基酸，推测这并不影响单 链蛋白的表达。但测序后发现在连接桥和 A24之间 多了一段 492 bp的来源不明的核苷酸片段，为此， 我们设计了环向 PCR, 沿目的序列环向扩增后将进 行平末端连接。我们推测，通过该方法，虽然体系中 仍有少量原始质粒（含多余片段），也能转化入感受 肽细胞，但大部分质粒应为不含多余片段的目的序 列。结果显示，在所有的九个克隆中有六个为目的克 隆，证明该环向扩增方法对于去除多余片段是非常 720· · 免疫学杂志 2010年 8月 第 26卷 第 8期 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 26 No. 8 Aug. 2010 有效的。 得到 hβ2m-A24-A2TM克隆后，我们首先将其 用 PEI转入 K41细胞，以抗 hβ2m的 L369单克隆抗 体为一抗，48 h观察瞬间表达情况。结果以蛋白印迹 的方法观察到较强的 hβ2m-A24-A2TM蛋白表达， 大小与预期相符，说明重组质粒 pcDNA3.1 / hβ2m- A24-A2TM的构建是正确的，目的蛋白能在小鼠细 胞中获得表达。下一步，我们构建能表达 hβ2m- A24-A2TM蛋白的小鼠 RMA-S细胞系。用 PEI法转 染 RMA-S细胞不成功，因此，改为电转方法。电转 后 48 h加药筛选，几周后得到了能在含 zeocin培养 基中生长的细胞系，经 Western blot鉴定，细胞系中 有 hβ2m-A24-A2TM的表达。将获得的细胞系进行 稳定地传代培养，应用 Western Blot进一步证明了 hβ2m-A24-A2TM在转染细胞系内的稳定表达。同 时，hβ2m-A24-A2TM的表达对细胞生长无毒性。至 此，我们成功构建了表达 hβ2m-A24-A2TM的小鼠 RMA-S 细胞系。我们还构建了表达 hβ2m-A24- A2TM的 CRT缺陷的小鼠 K42细胞系（数据未列）。 在表位的筛选中，多肽结合实验是一个非常重 要的筛选方法，从分子水平预测表位与相应 MHCI 类分子的结合能力。上述细胞系的建立为研究 A24 特异性表位奠定了基础。 致谢 本实验得到中国科学院微生物研究所高 斌研究员的指点和帮助。 【参考文献】 [1] 陈明水,陈强,李洁羽,等.Survivin HLA- A2+高亲和性 CTL表位的预测及鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2009, 16:3227- 3231. [2] 赵金华，黄 路，陈文昭，等. 尤文肉瘤 EWS- FLI1 蛋白 HLA- A2.1限制性 CTL表位的预测、筛选及鉴定 [J].免 疫学杂志, 2010, 26（1）:10- 15. [3] Baas EJ, Van Santen HM, Kleijmeer MJ，et al. Peptide- in- duced stabilization and intracellular localization of empty HLA class I complexes [J].J Exp Med, 1992, 176:147- 156. [4] Kondo A, Sidney J, Southwood S, et al. Prominent roles of secondary anchor residues in peptide binding to HLA- A24 human class I molecules [J]. Immunol, 1995，155: 4307- 4312. [5] Rock KL, Gramm C, Benacerraf B. Low temperature and peptides favor the formation of class I heterodimers on RMA- S cells at the cell surface [J]. PNAS, 1991, 88: 4200- 4204. [6] Howell D，Levitt JM，Foster PA，et al. Heterogeneity of RMA- S cell line: derivatives of RMA- S cells lacking H2- Kb and H2- Db expression [J]. Immunogenetics, 2000, 52(1/2): 150- 154. [7] Anderson KS, Alexander J, Wei M, et al. lntracellular trans- port of class t MHC molecules in antigen processing mutant cell lines[J]. lmmunol, 1993, 151: 3407- 3419. [8] 周 洪 . T细胞表位的确定[J].细胞生物学杂志 , 2002, 24(4) :196- 199. [9] Cheung YK, Cheng SC, Sin FW, et al. Investigation of im- munogenic T- cell epitopes in SARS virus nucleocapsid pro- tein and their role in the prevention and treatment of SARS infection[J]. Hong KongMed J, 2008, 14 (4):27- 30. [10] Erlich H, Lee JS, Petersen JW，et al. Molecular analysis of HLA class I and class II antigen loss mutants reveals a ho- mozygous deletion of the DR, DQ, and part of the DP region: implications for class II gene order [J].Hum Immunol, 1986，16:205- 219. [11] Sasada T, Takedatsu H, Azuma K, et al. IEX- 1, a stress in- ducible anti- apoptotic gene, encodes CTL epitopes capable of inducing HLA- A33- restricted and tumor- reactive CTLs in gastric cancer patientsJ]. Cancer Res, 2004, 64: 2882- 2888. [12] 刘庆军，韩化敏，张兆山，等.两种跨膜蛋白携带 myc于 细胞表面的能力比较 [J]. 生物学报, 2008, 24(11): 1888- 1894. （收稿日期：2010-03-23；修回日期：2010-04-18） （编辑 侯 瑞） 721· ·