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植物细胞工厂和粘膜疫苗

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植物细胞工厂和粘膜疫苗 垦 医堂 堕 治疗用生物制品分册2004年8月第2 7卷第4期 植物细胞工厂和粘膜疫苗 罗勇编译 陈受霓审校 【摘要】 植物疫苗领域正不断取得进展。植物能表达多成分疫苗,口服给予可诱导 I型T辅助细胞亚群(Th1)应答,并可进行被动免疫接种。已经进行了抗原稳定性、加 工处理和最佳免疫策略的初步研究。植物疫苗技术和生产规程的共同改进使这些原型 疫苗即将成为有用的商品 【关键词】 转基因植物;疫苗:抗原表位;免疫原性 【中图分类号】Q943.2 【文献标识码】A 【文章编号11000—6591(2004)04...
植物细胞工厂和粘膜疫苗
垦 医堂 堕 治疗用生物制品分册2004年8月第2 7卷第4期 植物细胞工厂和粘膜疫苗 罗勇编译 陈受霓审校 【摘要】 植物疫苗领域正不断取得进展。植物能表达多成分疫苗,口服给予可诱导 I型T辅助细胞亚群(Th1)应答,并可进行被动免疫接种。已经进行了抗原稳定性、加 工处理和最佳免疫策略的初步研究。植物疫苗技术和生产的共同改进使这些原型 疫苗即将成为有用的商品 【关键词】 转基因植物;疫苗:抗原表位;免疫原性 【中图分类号】Q943.2 【文献标识码】A 【文章编号11000—6591(2004)04—0159—03 重组药用蛋白质的生产有许多有效的途 径,而主要挑战在于达到大规模的成本一效益 生产。在过去5年中,用植物作为生物反应器 的潜力已得到证实。植物系统的优点有:经济 节约,投入成本低(如光照、水、矿物质);适于 大规模操作(种植更多的植物);受潜在的人 类病原体污染的危险最小;制品不需要提纯; 药物可以通过粘膜途径给予,因此简化了免 疫途径且降低了总成本。 植物药物可分为抗体、生物药物和疫苗 三类。植物抗体已经被广泛用于许多领域,包 括生物除污、植物抗病以及工业化纯化程序, 而最先进的是用于生产医药用抗体。关于生 物药物在植物中表达以及这些蛋白质的应用 已经有许多报道。然而,它们在商品化生产之 前还需要增强其表达水平。在过去12年中, 研究已证明植物疫苗成为商品是可行的。 1 植物疫苗技术 1.1抗原表达 亚单位疫苗由特异性大分子组成,它们 能诱导抗病原体的保护性免疫应答。在过去 几年中,有关转基因植物表达新抗原,或早先 已报道过的抗原表达方式的改变的报道越来 越多,使得用植物表达抗原作为疫苗继续受 人关注。已经研究了表达抗原的各种不同植 物和载体系统。Streatfield等用特定种子生 ·159· 产产肠毒性大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素 B亚单位(LTB),LTB的表达水 平达到 1.8 的总可溶性蛋白(TSP),两种独立的玉, 米培育使抗原产量增加了5倍和10倍。 Chikwamba等关于LTB在玉米中表达的研 究也第1次报告了在植物疫苗生产中使用粒 子轰击。试验证明了HBsAg(在马铃薯中表 达)、传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)S蛋白 (在马铃薯和烟草中表达)和 1型人免疫缺陷 病毒(HIV一1)表位(在马铃薯X病毒载体中 表达)的免疫原性。而免疫绿脓杆菌外膜F 蛋白表位(在烟草花叶病毒和流感病毒载体 中表达)、口蹄疫病毒(FMDV)VP1表位(在 马铃薯中表达)以及LTB(在玉米中表达) 后,经攻击试验表明也是成功的。 植物表达的抗原还有呼吸道合胞病毒G 和F蛋白、轮状病毒VP6蛋白、麻疹病毒 (MV)血凝素(H)蛋白以及恶性疟原虫主要 表面抗原表位(PfMSP1)。 1.2质粒转化 质粒基因组的转化为抗原表达提供了一 些有利条件,包括外源蛋白表达水平高,消除 了基因沉默的威胁以及由于缺少花粉传播而 造成的转基因抑制。Daniell等发表了通过叶 绿体转化研制植物疫苗的第1份报告。将未 修饰的霍乱毒素B亚单位(CTB)编码区整 —、J.■■,_■■■,r ■ 维普资讯 http://www.cqvip.com · 16O· 圄外医学预防诊断治疗用生物制品分册2004年8月第27卷第4期 合到叶绿体基因组中使烟草叶中CTB的积 累量达到约4.1 的TSP。GM 神经节苷脂 依赖性结合试验表明叶绿体合成的CTB保 持了其与肠膜受体结合的能力,但是免疫原 性研究还未进行。 1.3导向抗原 抗原以特定组织的方式在玉米仁、西红 柿果实和转基因烟草种子中表达,以试图促 进蛋白质的收获。将人巨细胞病毒主要糖蛋 白(gB)靶向转基因烟草种子已有描述,进一 步的研究显示重组gB几乎全部积存在成熟 烟草种子的蛋白储存囊泡中。 1.4融合蛋白 亚单位疫苗由于它具有“最小 ”特性, 通常很难在重组蛋白表达系统中检出和/或 不能诱导粘膜免疫。因此,常用外加蛋白质的 方法来改善这种情况。Gil等将抗原与编码p 葡萄糖醛酸酶(GUS)的基因融合以使其在 植物表达系统中的检测更容易,这是以GUS 活性为根据来选择转化株。已证实GUS与 犬细小病毒 2L21保护性表位以及FMDV 保护性表位融合具有免疫原性。免疫GUS— FMDV表位融合物的小鼠能完全抵抗天然 病毒的攻击。 已将CT有效用作植物疫苗中的导向蛋 白。Nemchinov等将霍乱弧菌CTB与丙型肝 炎病毒(HCV)表位(HVR1)融合,在烟草花 叶病毒(TMV)中表达。接种了重组TMV的 烟草植物能产生与具有功能活性五聚体 CTB融合的HVR1表位。植物CTB—HVR1 能与HVR1特异性单克隆抗体和 4种主要 基因型HCV感染者的血清产生反应。用含 有重组CTB—HVR1的植物粗提物鼻腔免疫 小鼠,能诱生血清抗CTB抗体和能与HCV 样颗粒特异性结合的抗HVR1抗体。 轮状病毒肠毒素蛋白(NSP4)的表位也 可与CTB融合,并在马铃薯中表达。在马铃 薯中表达多成分CT融合疫苗扩展了这项工 作的范围。这种疫苗由两种成分组成,一种是 CTB—NSP4表位融合物,另一种是F,T’EC菌 乇抗原与cTA成分(CTA2,能: 寻 亚单位 与CTB亚单位相联)的融合物。这两种融合 蛋白装配成霍乱全毒素样结构,保持了结合 肠细胞的亲和力。口服免疫小鼠能产生可检 测水平的抗天然抗原的特异性血清和粘膜抗 体。经免疫原攻击的免疫小鼠的孵细胞,可检 到白细胞介素2和7干扰素水平增加。说明 对这 3种植物合成抗原存在强烈的Th1免 疫应答。CD4 淋巴细胞数量的显著增加支持 了这一结论。被动免疫的新生小鼠经轮状病 毒攻击后,腹泻症状的严重程度减弱,持续时 间缩短。这是多成分植物疫苗的首次报告。 1.5优化免疫途径 免疫接种策略和程序对产生的免疫应答 有重要影响。Lauterslager等在小鼠中研究 了马铃薯LTB疫苗的效力,口服给予能在亲 代已接触过抗原的初免动物中诱生全身和局 部IgA应答。而与之差异较大的则是Haq等 报告的结果:在初免动物中能诱生显著的特 异性抗体应答,并可抵抗攻击。对此的解释包 括不适当的免疫程序、抗原剂量低、抗原免疫 原性低、不能准确检测抗体以及检测时块茎 的干扰等。 在小鼠试验中证实了植物MV H蛋白 的免疫原性后,为得到高滴度MV特异性中 和抗体,Webster等又对植物材料所需剂量 进行优化,并检测了植物疫苗对MV H DNA 免疫的加强作用。接种单剂DNA后,口服多 剂植物疫苗作为加强,诱生的MV中和抗体 的量显著大于单独DNA或植物疫苗接种。 这是首次证实DNA疫苗与口服植物疫苗联 用的初免一加强免疫策略可以增强免疫应答。 2 植物疫苗的加工处理及稳定性 需要有可靠的方法来定量植物抗原并保 证它们的稳定性。Lee等将表达Mannheimia haemdytica A1白细胞毒素 5O融合蛋白的 三叶草收获后,在室温和周围湿度下干燥 1~4天,3天后的三叶草组织保留约2O 的 维普资讯 http://www.cqvip.com 国外医学预防诊断治疗用生物制品分册2004年8月第27卷第4期 最初鲜重,没有发现融合蛋白有显著降解。因 此,不需要用冷藏来保持融合蛋白的稳定性。 此融合蛋白注射家兔可诱导免疫应答,在改 良的中性红细胞毒性试验中能识别和中和天 然抗原。 Smith等进行了一项更全面的稳定性研 究,发现具有抗原反应性的HBsAg的定量 很大程度上取决于去污剂与细胞浓度的比 率。在提取缓冲液中,1 ~2O%w/V浓度的 抗坏血酸钠能使检到的单克隆反应性抗原水 平增加4~12倍。在4 C时去污剂也影响细 胞裂解物中抗原的稳定性。在最适宜的条件 下,稳定性至少可保持1个月,然而过量的去 污剂使抗原容易发生蛋白酶解性降解。添加 脱脂牛奶或其蛋白成分可抵抗蛋白酶解,使 抗原稳定性保持2个月。通过改变抗坏血酸 钠的浓度或缓冲液的pH,显现单克隆反应性 表位的HBsAg增加了8~20倍。尽管抗原的 稳定性将在逐项事实的基础上进行研究,但 显然植物抗原的免疫原性和稳定性的提高可 以用简单的体外操作来证实。 Castanon等研究了由VP60基因组成 的兔出血病病毒(RHDV)马铃薯疫苗的最短 加工处理过程。在3个月内,将收获的马铃薯 去皮、切片、冻干、研磨成粉、贮存、用于试验。 用马铃薯粉提取物皮下注射初免家兔,再以 肌肉注射加强免疫。此转基因马铃薯可诱生 特异性抗体应答,保护家兔抵抗有毒力 RHDV的攻击。 3 疫苗的临床试验 在2000年发表的植物疫苗 I/Ⅱ期临床 试验中,志愿者口服受块茎特异性patatin启 动子控制的、表达诺沃克病毒衣壳蛋白 (NVCP)的转基因马铃薯后,95 的受试者 的特异性IgA抗体分泌细胞显著增加,2O 产生血清特异性 IgG,30 产生粪便特异性 IgA。虽然血清特异性抗体的增加不多,但可 通过使用佐剂来改善NV样颗粒的组装以及 增加重组蛋白的剂量来增强NVCP的免疫 · 161· 原性 。 2002年 8月报道了植物疫苗的另一项 人体临床试验。将狂犬病病毒糖蛋白(G蛋 白)和核蛋白(N蛋白)与三叶草花叶病毒 (A1MV)的外壳蛋白(CP)融合,14名志愿者 口服表达此融合蛋白表位的转基因菠菜后,5 名以前曾免疫过传统狂犬病疫苗者中3人,9 名以前未免疫过疫苗者中5人有明显的狂犬 病病毒特异性抗体应答,而对照者则无此抗 体的显著增加。完成服用程序后7天,再给予 9名先前未免疫者 1剂传统狂犬病疫苗,结 果其中3人产生了抗狂犬病病毒中和抗体, 而5名对照者无此抗体产生。虽然在免疫商 用疫苗前没有检得中和抗体,但明显表明植 物狂犬病疫苗能作为抗狂犬病免疫的补充口 服加强剂。 4 结语 植物疫苗在用作商品前需要进一步对每 个抗原进行深入研究。目前考虑得更多的是 关于植物疫苗的规程和食物链受这些药物污 染的安全性问题。籍于这个原因,食用疫苗的 初步概念应是进一步开发廉价的植物粘膜疫 苗,通过来加以规范,且不能像用于现代 化农业生产的其他转基因植物那样放松管 理。在美国,美国农业部(USDA)及食品和药 品管理局(FDA)统筹植物药物的管理。US— DA规定转基因植物表达药物的定位和防 范,FDA确保质量保证(QA)和质量控制 (QC)。FDA保证在生产和原料的准备中保 持QA和QC,以确保人用的安全和有 效。FDA还通过分阶段进行的临床试验监测 确定加工植物药物的相对危险性,以颁发生 产许可。最近,FDA发布了植物药物生产的 第一部规程草案。 参考文献 1 Walmsley AM et a1.Curr Opin Biotechnol,2003,14: - 145—150. 2 Farran I et a1.Transgenic Res,2002,I I:337—346. 3 Vusibov V et a1.Vaccine.2002,20:3155—3164. (收稿日期:2003—12—10) 维普资讯 http://www.cqvip.com
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