GBT 14926.46-2008 实验动物 钩端螺旋体检测方法

ICS65．020．30 B44 囝宦 中华人民共和国国家标准 GB／T14926．46—2008 代替GB／T14926．462001 实验动物 钩端螺旋体检测 Laboratoryanimal--MethodforexaminationofLeptospiraspp． 2008-12-03发布 2009—03—01实施 宰瞀粥紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会议19 刖 罱 GB／T14926．46—2008 GB／T14926《实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。 本部分自实施之日起代替GB／T14926．46—2001《实验动物钩端螺旋体检测方法》。 本部分与GB／T14926．46—200l相比主要技术差异如下： a) 原理部分增加显微镜凝集试验原理； b)原标准中“6．1试管凝集实验”修改为“显微镜凝集实验”；“6．1．2．2表1钩端螺旋体定量 显凝试验操作方法”更改为“钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法”； c) 修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容； d)在原标准中增加了“7结果判定”。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。 本部分主要起草人：范薇、田克恭、贺争鸣。 本部分所代替标准历次版本发布情况为： ——GB／T14926．46—2001。 实验动物 钩端螺旋体检测方法 GB／T14926．46—2008 1范围 GB／T14926的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。 本部分适用于犬钩端螺旋体的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB／T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分。 GB／T14926．42实验动物细菌学检测标本采集 GB／T14926．43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂 GB／T14926．50实验动物酶联免疫吸附试验 3原理 钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇，在适宜的电解质存在下发生凝集现象，此种凝集一般须用 暗视野显微镜检查。 钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合，形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保 持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。 颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。 4主要设备和材料 4．1普通恒温培养箱。 4．2实体显微镜。 4．3恒温水浴箱。 4．4高速离心机。 4．5超声波细胞粉碎器。 4．6酶标仪。 4．7微量加样器，容量5pL～50pL和50pLy200pL。 5培养基及试剂 5．1犬型钩端螺旋体标准抗原。 5．2标准阳性血清。 5．3标准阴性血清。 5．4生理盐水。 5．5显微镜凝集抗原：各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基，28℃培养5d～7d。取样作暗视 野显微镜检查，每400倍视野不少于50条，运动活泼并无自凝现象者，可作为抗原。 5．6 ELISA抗原 5．6．1钩端螺旋体培养：各群钩端螺旋体标准株接种Korthof培养基，28℃培养5d～7d。 】 GB／T14926．46—2008 5．6．2生长良好的培养物用10000r／min离心30min，沉淀用PBS在相同条件下洗2次。 5．6．3上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，10000r／min离心20rain，上清即为ELISA抗原。 5．7酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬IgG抗体，辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)。 5．8阳性血清：钩端螺旋体免疫SPF犬所获得的血清，或自然感染犬后所获得的血清。 5．9阴性血清：无钩端螺旋体感染犬血清。 5．10培养基和试剂溶液的配制：参照GB／T14926．43和GB／T14926．50执行。 6检测方法 6．1显微镜凝集实验 6．1．1检测程序 检测程序见图1。 图1检测程序 6．1．2操作步骤 6．1．2．1采样 采血、分离血清。采样方法参照GB／T14926．42执行。 6．1．2．2血清稀释 参照表1进行。 表1 钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法 凹孔板编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1l 12 生理盐水／mL 0．16 0．1 O．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 待检血清／mL 0．04／0．1夕0．1夕0．1，0．1夕0．1夕0．1／0．1夕0．1≯ 弃去 0．1 阴性血清／mL 0．1 阳性血清／mL 0．1 标准抗原／mL 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0 1 0．1 0．1 0．1 O．1 血清最终稀释度 1／10 1／Z0 1／40 1／80 1／1601／320l／6401／12801／Z560 GB／T14926．46—2008 6．1．2．2．1待检血清灭活：将待检血清以56℃水浴灭活30rain后备用。 6．1．2．2．2取96孔板，第1孔加人生理盐水0．16mL，以后每孔加入生理盐水0．1mL，一直加到 第9孔。 6．1．2．2．3在第1孔中加入血清0．04mL，混匀后，吸取o．1mL到第2孔，如此类推，直到第9孔，弃 去0．1mL。 6．1．2．3对照 另标明10、11、12孔，第10孔加人阴性血清0．1mL，第11孔加入阳性血清0．1mL，第12孔加人 生理盐水0．1mL。 6．1．2．4加入抗原 将各孔加入标准抗原0．1mL，混匀，此时各孔血清稀释度为1：10，1：20，1：40，1：80，1：160， 1：320，1：640，1：1280，1：2560。具体操作见表1。置37℃温箱2h，取出后摇匀，用接种环挑取 各孔中的反应物置于载玻片上，在暗视野下观察结果。 6．1．2．5结果判定 结果判定如下： a)++++：几乎全部钩端螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块，或有大小不等的点状或块状残 片，仅有少数游离的钩端螺旋体； b) +++：75％的钩端螺旋体被凝集，大部分呈块状或蜘蛛状，尚有25％菌体游离； c)++：50％左右的钩端螺旋体被凝集，尚有50％菌体游离； d) +：25％左右的钩端螺旋体被凝集，尚有75％菌体游离； e) 一：全部菌体正常，分散，无凝集块，菌数与对照相同。 待检血清凝集效价在1：20达到“++”或以上时，均判为阳性反应。 6．2酶联免疫吸附试验(ELISA) 6．2．1包被抗原 根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释。每孔100pL，置37℃1h后再4℃过夜。 6．2．2用洗涤液洗3次，每次5rain，叩干。 6．2．3加样 待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1：160稀释，每孔100pL，37℃1h，洗涤同上。 6．2．4加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加入100pL，37℃1h，洗涤同上。 6．2．5加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液100pL，置37℃，避光显色10min～15min。 6．2．6终止反应 每孔加人终止液50“L。 6．2．7测A值 在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。 6．2．8结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。 6．2．8．1同时符合下列2个条件者，判为阳性： a)待检血清的A值大于等于0．2； b) 待检血清的A值／阴性对照血清的A值大于等于2．1。 6．2．8．2均不符合上述2个条件者，判为阴性。 6．2．8．3仅有1条符合者，判为可疑，需重试。如仍为阳性则判为阳性。 6．2．8．4对阳性结果需重试，如仍为阳性则判为阳性。 GB／T14926．46—2008 7结果判定 7．1基础级犬 如接种疫苗后，经ELISA检测抗体效价大于等于1：160，或显微镜凝集检测抗体效价大于等于 1：20判为合格。被检动物免疫抗体合格率大于等于70％可判为该犬群免疫合格。 免疫抗体合格率一(被检动物抗体阳性数／被检动物总数)X100％ 7．2 SPF级犬 不应进行疫苗接种，或未进行免疫的基础级犬，对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重 试。如仍为阳性则判为阳性。 8结果 根据判定结果，作出报告。