灵芝三萜对化学性肝损伤保护作用研究

灵芝三萜对化学性肝损伤保护作用研究 探讨服用灵芝三萜对小鼠因CCl4诱导的肝损伤的保护作用。方法 连续30d给予动物受试物后，模型组及各剂量组动物给予3.2 mg/mL的CCl4染毒，测定ALT、AST，并取肝脏进行组织病理学检查。结果 灵芝三萜可明显抑制CCl4引起小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的升高，试验结束时，模型组ALT值为9658.5 U/L，中、高剂量组分别为5899.2、3773.3 U/L；模型组AST值为4962.8 U/L，高剂量组为1999.9 U/L，并能改善和恢复肝脏组织的病理指标。结论 灵芝三萜对由CCl4引起的肝脏损伤有较好的保护作用。 现代医学还没有治疗肝疾患的有效药物[1]。肝病仍然是严重威胁人类健康的疾病之一。灵芝属担子纲菌，多孔菌科植物，据《中国真菌志》记载，我国灵芝有98种，主要有赤芝，紫芝，薄盖灵芝，树舌芝，云芝等。灵芝具有补中益气，滋补强壮，扶正固本，延年益寿等功效，是一种珍贵的中药材。灵芝三萜(Ganoderma Triterpene，GT)是灵芝的主要成分之一，目前从各种灵芝中分离到的三萜类化合物已达122种[2]。过去的研究发现灵芝三萜具有如抑制组胺释放、抗高血压、抗肿瘤、抗HIV－1及HIV－1蛋白酶活性等广泛的药理活性。随着科学技术不断进步，灵芝三萜也越来越多地被人们应用于药品和食品，为此进行初步研究，以期为综合利用灵芝三萜提供参考依据。 1 材料与方法 1.1受试物 灵芝三萜胶囊，内容物为棕褐色粉状，用蒸馏水将受试物溶解配成3个剂量组进行实验。 1.2实验动物 上海斯莱克实验动物有限公司提供的清洁级ICR健康雄性小鼠60只，体重18～22g，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，动物按体重随机分成5组，每组12只。 1.3剂量选择 该受试物人日推荐量为3.2 g（成人体重以60 kg计），按人推荐量的5倍、10倍、30倍设3个剂量组，分别为0.26 g/kg BW、0.53 g/kg BW、1.60 g/kg BW。低、中、高剂量组分别按13.0、26.5、80.0 mg/mL浓度配制，另设溶剂对照组（蒸馏水）和CCl4模型对照组。CCl4的溶剂选用精制玉米油，CCl4剂量为32 mg/kg BW。 1.4饲养环境 福建省疾病预防控制中心SPF级动物，许可证号：SYXK（闽）2007-0006 1.5受试物给予途径：动物每日按0.02mL/g体重经口灌胃，连续30d。 1.6主要仪器与试剂 1.6.1主要仪器 日立7060C全自动生化分析仪；生物组织自动脱水机；生物组织冷冻包埋机；Finesse325石蜡切片机；全自动染色机；BX-51显微镜；电子天平等。 1.6.2试剂 生化试剂盒由北京九强生化试剂有限公司提供；四氯化碳（CCl4）分析纯由上海长江化工厂生产，用精制玉米油配制成浓度为3.2mg/mL。 1.7方法 3个剂量组动物每日经口灌胃给予试验物，溶剂对照组和肝损伤模型对照组给予蒸馏水。动物每周称重2次，以调整受试物剂量，自由饮食饮水。于试验第30d将各组动物隔夜禁食16h，于第31d，肝损伤模型组及各受试组动物按10mL/kg BW 进行1次性灌胃给予3.2mg/ml的CCl4造模，溶剂对照组给予玉米油。给予CCl424h后摘眼球取血，分离血清，测定ALT、AST，同时处死动物，取肝脏进行外观观察和组织病理学检查。 1.8实验数据统计 试验数据以SPSS软件进行方差分析。溶剂对照组和CCl4模型对照组比较用t检验；各受试物组与CCl4模型对照组比较用单因素方差分析。经方差齐性检验，方差齐的实验数据采用LSD法进行统计分析；对方差不齐或非正态的实验数据先进行变量转换再进行统计[3]。 2 结果 2.1该受试物对小鼠体重的影响 各组小鼠的初始体重经方差分析，差异无统计学意义（F=0.061，P>0.05），即小鼠的初始体重在各组间较为平衡；经口灌胃30d后，各组小鼠的体重增长值经方差分析，差异无统计学意义（F=0.382，P>0.05），即该受试物对小鼠的体重增长无影响。结果见1。 2.2 对血清ALT、AST的影响 试验结束时CCl4模型对照组小鼠的ALT、AST含量比溶剂对照组高，经统计分析差异有统计学意义（F=11.258、22.481，P<0.05）。中、高剂量组的ALT值低于CCl4模型对照组，经统计分析差异有统计学意义（F=5.574，P<0.05）；高剂量组的AST值低于CCl4模型对照组，经统计分析差异有统计学意义（F=3.397，P<0.05）。结果见表2。 2.3肝脏组织病理学检查结果： 2.3.1 肉眼观察 溶剂对照组：肝脏表面平整光滑、色泽亮呈鲜红色、质软。 CCl4阳性组：肝脏表面有颗粒状，色泽变淡呈土黄色，质稍硬。 各剂量组：肝脏表面有均匀细颗粒，色泽呈略黄、深褐色或土黄色，质软或稍硬。 2.3.2 镜检 CCl4模型对照组肝损伤程度明显高于溶剂对照组，中、高剂量组的胞浆凝聚积分、高剂量组的肝细胞坏死积分和高剂量组的总分指标低于CCl4模型对照组，经统计分析差异有统计学意义（F=4.734、3.614、3.689，P<0.05），见表3。 　 3 讨论 众所周知多种致病原因可导致肝损伤，如病毒、酒精和药物等。各种有害因素所致的肝损伤可表现为肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、肝纤维化、肝硬化及肝癌等。对肝损伤的防治目前仍是一个全球性的严峻课题。而通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有十分重要的现实意义。 关于CCl4的肝毒作用机制，研究较多，存在多种意见，但都一致公认，自由基的形成及引发的链式过氧化反应是其主要机制。CC14在肝内主要被微粒体细胞色素氧化酶代谢，生成两个活性自由基(CC13O2•和C1•)及一系列氧活性物，并诱导膜系统发生脂质过氧化反应，膜磷脂大量降解，从而破坏生物膜结构的完整性，引起膜通透性增高，最终导致肝细胞死亡。人们还发现CC14的代谢产物能迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA等多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡。特别是自由基作用于DNA时，损伤核糖和碱基，使核酸直接破坏，引起DNA链的断裂或DNA链间或与蛋白质问交联，影响其信息传递功能以及转录和复制特性，改变癌基因和抑癌基因的活性状况，最后可引发细胞增殖失控而至癌变。一些研究还表明，在CC14代谢产物引起的脂质过氧化和共价结合的双重作用下，导致膜脂流动性降低，钙泵抑制，谷胱甘肽活性抑制，肝微粒体和线粒体功能丧失，肝细胞内钙稳态失调，代谢紊乱，最后使肝细胞损伤加剧。脂肪肝也是CC14中毒的一个重要表现。此外，CC14所致的慢性或反复性肝损害可导致纤维组织增生，最后可形成肝硬变[4]。 近年研究发现，灵芝三萜具有如抗肿瘤、抗炎症反应、抗高血压、抗微生物等广泛的药理活性[5]。灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。自1983年Toth首先报道了灵芝三萜类化合物的抗肿瘤作用以来，随之灵芝三萜包括三萜酸、醛、醇的抗肿瘤报导也不断增多。业已证明，灵芝三萜抑肿瘤机制有：(1)细胞周期阻滞(2)诱导细胞凋亡(3)抑制肿瘤血管生成[6]。 此外，灵芝三萜还有诸如抑制真核细胞DNA 多聚酶活性、活血化淤、调节神经系统、促进智力和延缓衰老等等其他药理作用，但因灵芝三萜类化合物结构复杂，分子中功能基团较多，目前只有少数化合物进行了药理活性研究，多数仍未进行活性研究，灵芝三萜各单一化合物具体的药理作用还未完全明确。为了使灵芝三萜对肝损伤保护作用的药理活性逐步明确，以便为将来临床药用提供更多的理论依据，有必要采用现代科学技术方法对其药理作用、构效关系、作用机理等方面进行深入和系统地研究，为开发利用灵芝资源打下坚实的基础。 该课题采用经典的四氯化碳模型，同时以低、中、高剂量灵芝三萜给予动物，通过血清生化指标的检测，发现灵芝三萜能够明显抑制CCl4引起小鼠血清ALT和AST的升高，ALT、AST是存在于肝细胞浆内的可溶性酶，肝细胞损伤后，细胞膜的通透性增加，导致ALT、AST释放入血，故血清ALT、AST水平高低可以反映肝细胞的损伤程度；此外灵芝三萜还能使肝脏组织形态学上的肝细胞变性、坏死程度得到明显的改善和恢复，表明其对CCl4引起的肝脏损伤有较好的保护作用。