小鼠精子顶体发生的形态学研究

200　 解放军医学杂志　2012年3月1日　第37卷　第3期 [摘要]　目的　探讨小鼠精子形成过程中顶体发生的形态学变化特点，为深入研究顶体对男性生殖功能的影响提 供理论基础。方法　应用PAS染色法，在光学显微镜下区分小鼠睾丸生精上皮周期中不同时相的生精上皮，观察精子 细胞顶体在不同时相的形态学变化特点。结果　精子细胞顶体含有多糖类物质，经PAS染色后呈紫红色。小鼠精子发 生的最后1个半周期为精子形成过程，也是顶体的发生过程。在圆形精子细胞期，顶体变化由圆形、椭圆形至左右对 称的帽形，角度逐渐增大；在变形精子细胞早期，顶体由左右对称的帽形演变成位于头背部的镰形；在变形精子细胞 晚期，顶体位于头背部。结论　上述对小鼠精子顶体发生过程中形态学变化特点的观察为进一步研究顶体发生机制及 临床评价男性生育力奠定了基础。 [关键词]　精子；顶体；生精上皮 [中图分类号]　R321.1 [文献标志码]　A [文章编号]　0577-7402(2012)03-0200-04 Morphological study of sperm acrosome development in mice TIAN Hong-yan, LI Zhi-xin*, WANG Hong-jun, LIN Dong-jing, LIU Zhong-ping, PAN Xiao-yan, LI Hong-yu, DOU Zhao-hua Department of Histology and Embryology, Jilin Medical College, Jilin City, Jilin Province 132013, China *Corresponding author, E-mail: lzx-62@163.com This work was supported by the “Eleventh Five-Year” Science and Technology Research Project of Jilin Provincial Department of Education (2007433, 2008400) [Abstract]　Objective　To investigate the characteristics of the morphological changes in acrosome development during the spermiogenesis of mice, and to provide the basis for further studies of the effects of acrosome on the male reproductive function. Methods　Periodic-acid Schiff (PAS) staining was used to identify the seminiferous epithelium in the different stages of the spermatogenic cycle of mice testicle under light microscope. The characteristics in the morphological changes in the spermatid acrosome in different phases were observed. Results　According to the criterion of the time phase of seminiferous epithelium as proposed by Clermont and Russell, the cycle of the seminiferous epithelia could be divided into 12 stages. The acrosome had their respective characteristics in each stage, which reflect the entire processes of mice sperm acrosome development. Conclusions　The characteristics of the morphological changes during the processes of mice sperm acrosome development in different phases can be observed with a light microscope. It can provide the morphological basis for further studies on the impact of all factors on\acrosome development and sperm function, and on the mechanism of acrosome development. This research can also provide experimental evidence for further studies on the effects of acrosome on male reproductive function, and provides a powerful parameter for the clinical evaluation of male fertility. [Key words]　spermatozoa; acrosome; seminiferous epithelium 小鼠精子顶体发生的形态学研究 田洪艳，李质馨，王弘珺，林冬静，刘忠平，潘晓燕，李宏宇，窦肇华 [基金项目]　吉林省教育厅“十一五”科技研究项目(2007433， 2008400) [作者简介]　田洪艳，理学硕士，副教授。主要从事生殖医学 的研究 [作者单位]　132013　吉林省吉林市　吉林医药学院组织学与 胚胎学教研室(田洪艳、李质馨、王弘珺、林冬静、刘忠平、潘 晓燕、李宏宇、窦肇华) [通讯作者]　李质馨，E-mail：lzx-62@163.com 近年来男性不育症的发病率逐年增加，其主 要因素是精子功能受损[1]。顶体是精子头部的重要 组成部分，顶体发生过程异常最终会影响男性的生 育能力[2]，因此其形态是否正常是评价男性生育力 的重要参数之一[3]。顶体形态结构异常说明顶体酶 缺失或活性降低，顶体反应异常，精子不能穿越放 射冠和透明带，导致受精率降低[4]。临床研究已表 明，许多男性不育症与顶体反应异常密切相关[5]。 某些男性不育或生育能力低下可以追溯到顶体发生 过程的某个环节异常，而某个环节异常又可能是由 于某种基因表达异常所致[6-9]。因此，了解顶体发 生过程的形态学特点有助于生殖生物学的基础与临 床研究。本研究观察小鼠精子顶体发生过程中的形 态学变化特点，现如下。 Med J Chin PLA, Vol. 37, No. 3, March 1, 2012 　201 1　材料与方法 1.1　实验动物　健康成年雄性清洁级ICR小鼠20 只，体重25±2g，由吉林大学动物实验中心提供。 饲养温度18～22℃，相对湿度45%～55%，规律光 照，自由饮食，适应性饲养1周后开始实验。 1.2　主要试剂及仪器　多聚甲醛(国药集团化学试 剂有限公司)，高碘酸(上海海曲化工有限公司)， 碱性复红和重亚硫酸钠(天津大茂化学试剂厂)，盐 酸(上海鼎盛化工有限公司)，Leica-RM2245石蜡切 片机(德国)，Olympus-DP71数码显微镜(日本)。 1.3　标本制备　0.4%戊巴比妥钠(200mg/kg)腹腔注 射麻醉，打开胸腔，暴露心脏，4%多聚甲醛灌流 固定，待小鼠四肢、尾部僵直后取睾丸，放入4% 多聚甲醛中继续固定，常规脱水、透明，石蜡包 埋，Leica-RM2245石蜡切片机切片，厚5μm。 1.4　PAS染色　切片常规脱蜡至水，0.5%过碘酸氧 化液染色10min，蒸馏水洗2次，Schiff液避光染色 15min，流水冲洗5min，苏木素复染1min，0.5%盐 酸乙醇分化，流水冲洗至细胞核变蓝。常规脱水、 透明、封固。 1.5　光镜观察　Olympus-DP71数码光学显微镜 (×1000)下区分出小鼠睾丸生精上皮周期中不同时 相的生精上皮，观察精子细胞顶体在不同时相的形 态学变化特点。 2　结　　果 根据Clermont等[10]及Russell等[11]制定的分期标 准，小鼠精子发生经历4个半生精上皮周期，第1－ 4个周期都分为12期，最后半个周期分为8期，其中 最后的1个半周期为精子形成过程，也是顶体的发 生过程。精子顶体含有多糖类物质及各种水解酶， PAS染色后呈紫红色，胞核被苏木素复染成蓝色。 本研究镜下观察发现，各期顶体形态特征变化明 显，可用以直接判定生精上皮处于哪一期，具体表 现如下。 2.1　第4个周期　小鼠生精上皮周期的第4个周期 包括圆形精子细胞期和变形精子细胞早期，同时也 是顶体发生的关键期。在这一周期的每期里，精子 细胞的顶体具有独特的形态学特点，呈现明显的变 化趋势，体现了完整的动态发生过程(图1)。 2.1.1　圆形精子细胞期　第Ⅰ－Ⅷ期为圆形精子 细胞期，此阶段精子细胞均为圆形，顶体变化由圆 形、椭圆形至左右对称的帽形，角度逐渐增大，各 期均有显著的判定。 Ⅰ期：核周边未见顶体囊泡。 Ⅱ期：近核膜处见一小而圆的顶体囊泡，结构 清晰，与囊泡相贴处的核膜略内陷。 Ⅲ期：顶体囊泡呈椭圆形，长轴与核膜表面平 行，核膜内陷加深。 Ⅳ期：顶体囊泡呈扁平帽状，中部略厚，周 缘较薄，沿核膜扩展约核周长的1/9，核膜凹陷消 失。 Ⅴ期：顶体帽呈月牙形，形态规整，左右对 称，包绕核周长的1/4左右。 Ⅵ期：顶体帽包绕核周长的1/3。 Ⅶ期：顶体帽的长度超过核周长的1/3，但未 与胞膜相贴。 Ⅷ期：顶体帽与胞膜贴近，且顶体帽均朝向生 精小管基底面。 2.1.2　变形精子细胞早期　第Ⅸ－Ⅻ期为变形精子 细胞早期，圆形精子细胞经过半圆形、宽梭形、长 梭形逐渐演变成细长形，顶体也由左右对称的帽形 演变成位居头背部的镰形。 Ⅸ期：核呈半圆形，形成头部雏形，扁平侧为 腹部，隆起侧为背部，顶体帽贴附于背部前端，头 部呈椭圆形，尾部细长。 Ⅹ期：核呈宽梭形，顶体帽沿头部背侧向顶体 后区延伸，头部变扁，向核的腹侧弯曲。 Ⅺ期：核呈长梭形，顶体帽继续延伸。 Ⅻ期：核呈细长形，顶体帽位于背侧，呈镰 形。 2.2　第4个半周期　第4个半周期为变形精子细胞 晚期，变形精子细胞头部细长形，略向腹部弯曲， 顶体位于头背部，残余胞质逐渐脱落。第Ⅷ期末， 成熟精子已形成且均位于管腔最内侧，并最终释放 入管腔。此阶段，变形精子细胞及顶体形态变化不 大，只是精子细胞位置由支持细胞深部逐渐迁移至 管腔面(图2)。 图1　第4个周期小鼠精子顶体形态变化 Fig. 1　Morphology changes of mice sperm acrosome in the 4th cycle ↑ show the acrosome; bar=2μm 202　 解放军医学杂志　2012年3月1日　第37卷　第3期 Ⅰ期：核位于细胞一端，胞质逐渐向尾部迁 移，顶体位于头部前端及背侧。 Ⅱ期：胞质进一步移向尾部，顶体在头部前端 及背侧清晰可见。 Ⅲ期：精子细胞头部前端稍弯曲，头部背侧可 见顶体。 Ⅳ期：核进一步浓缩，头部背侧顶体清晰，略 弯向腹部。 Ⅴ期：顶体清晰，略弯向腹部。 Ⅵ期：顶体清晰，略弯向腹部。 Ⅶ期：变形精子细胞从支持细胞深部移至近管 腔面，胞核进一步浓缩变小，顶体位于头部前端背 侧，残余胞质脱落。 Ⅷ期：精子形成，头部前端略尖，并弯向一 侧，顶体呈明显的镰状。此期末，成熟精子释放入 管腔。 3　讨　　论 在精子发生过程中，生精细胞在生精上皮中 的排列是严格有序的，这一特定的细胞集落称为细 胞组合(cell association)。不同发育阶段的细胞组合 是不同的，从某一特定的细胞组合开始到下一次出 现同一细胞组合所经历的时程，称为一个生精上皮 周期(cycle of seminiferous epithelium)。一个生精上 皮周期要经历不同的细胞组合，各种细胞组合称期 (stage)。根据Clermont等[10]及Russell等[11]制定的分 期标准，小鼠的精子发生要经历4个半生精上皮周 期。第1个周期是A型精原细胞增殖并分化为中间型 精原细胞；第2个周期是中间型精原细胞转化为B型 精原细胞，并进入减数分裂前期，形成细线前期、 图2　第4个半周期小鼠精子顶体形态变化 Fig. 2　Morphology changes of mice sperm acrosome in the 4th and a half cycle ↑ show the acrosome; bar=2μm 细线期和偶线期精母细胞；第3个周期是形成粗线 早期、粗线中期、粗线晚期和双线期精母细胞，并 完成第一次减数分裂，形成次级精母细胞；第4个 周期是形成圆形精子细胞并完成变形精子细胞的早 期转变；第4个半周期是完成变形精子细胞的晚期 转变，形成细长形精子细胞，最终精子成熟、释放 入管腔。睾丸生精上皮周期及各期生精细胞的形态 特点是研究精子发生组织学、病理学及毒理学改变 的基础，已经成为生殖生物学研究的主要内容[12]。 小鼠精子顶体发生是精子形成过程中的重要事 件[13]，是伴随精子形成而发生的，占据了第4个和 第4个半生精上皮周期。第4个周期是顶体发生的关 键期。在此关键期中，顶体从无到有，从小到大， 从圆形到镰形，经历了复杂的发生及演变过程，每 一步变化都是严格有序的，受多种基因调控，且对 多种因素极为敏感，决定了顶体最终的结构与功 能。顶体发生的相关基因具有时相特异性，在不同 时相的基因表达量及定位差异明显，如膜蛋白Afaf 在圆形精子中高表达，主要定位于形成中的顶体 内、外膜，而在成熟的顶体中表达量较少[13]；蛋白 FerT则主要表达于前顶体囊泡及顶体外膜[14]。某些 男性不育症可能就是由于顶体发生过程中某一期异 常所致，形成的精子缺乏顶体或顶体薄、体积小、 呈泡状、内容物缺乏或电子密度低，从而影响了精 子的功能，而某一期异常可以追溯到相关基因的异 常。因此，对精子顶体发生进行准确的分期，对各 期进行准确的形态学描述具有重要意义。 对于男性生育能力的判定，精子质量较精子数 量更能说明问，因为精子的质量决定了精子的功 能[15-16]。研究显示，即使是轻度不定型精子及适度 长形精子，如果顶体形态正常也可与透明带紧密结 合[17]。可见，顶体形态分析相对于精子形态分析更 能反映精子的功能[18]。精子顶体发生是一个动态过 程，存在着时相差异性[12]。因此，对于顶体及诸多 影响因素的研究要有精确的分期，不同组别间的比 较要在同一期内进行，不能简单而笼统地说某基因 或蛋白有所表达或表达有所改变，只有同一期比较 的结果才真实可信。本研究结果显示精子顶体含有 多糖类物质，经PAS染色后呈紫红色，胞核被苏木 素复染成蓝色，在光镜下极易辨别，也是判定生精 上皮周期的标志。生精上皮周期的最后1个半周期 为精子形成过程，也是顶体发生的过程，各期顶体 形态变化特点明显。本研究结果可为生殖生物学的 基础和临床研究提供形态学判定标准，进而为深入 研究顶体对男性生殖功能的影响提供实验依据，为 临床评价男性生育力提供相应参数。 Med J Chin PLA, Vol. 37, No. 3, March 1, 2012 　203 【参考文献】 [1] Aitken RJ, Baker MA, De Iuliis GN, et al. 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