基因组学（5）

nullnull华东理工大学生物科学专业核心课程基 因 组 学张 惠 展基 因 组 学导论：基因组与基因组学基 因 组 学5 2 3 4 1 7 结构基因组学：基因组作图结构基因组学：基因组测序结构基因组学：基因组解析功能基因组学：基因组达比较基因组学：基因组进化6 功能基因组学：基因组遗传功能基因组学：基因组表达基因组表达的调控功能基因组学：基因组表达5 A 基因组转录图谱的绘制基因组差异表达的研究5 B 5 C 功能基因组学的一大任务是绘制基因组的转录图谱null5 A 基因组表达的调控机制 基因的表达是指基因在细胞内部和外部因子的联合作用下进行转录和翻译，这一过程受到多重机制的严密调控；而基因组表达的关键性调控机制则决定哪些基因表达和那些基因沉默，即基因表达开与关的选择，因此基因组表达的关键调控环节位于转录起始阶段。基因组处于转录起始的状态称为基因组的表达活性。null5 A 基因组表达的调控机制a 基因组活性的瞬时可逆变化基因组表达活性的瞬时变化主要在细胞对胞外环境刺激的应答时发生。胞外环境刺激因子通过两种方式影响胞内基因组表达活性：直接作用：信号传递胞外刺激因子跨膜进入细胞胞外刺激因子作用与细胞表面受体，后者将信号传入细胞间接作用：信号转导表面受体null5 A 基因组表达的调控机制a 基因组活性的瞬时可逆变化由胞外环境刺激因子介导的信号传递胞外刺激因子跨膜进入细胞后直接激活或阻遏转录：启动子增强子乳铁蛋白转录激活因子由转录因子装配起来的转录机器乳铁蛋白作为null5 A 基因组表达的调控机制a 基因组活性的瞬时可逆变化由胞外环境刺激因子介导的信号传递胞外刺激因子跨膜进入细胞后直接影响转录激活因子活性：启动子增强子类固醇激素转录激活因子激素受体糖皮质激素受体雌激素受体维甲酸受体甲状腺激素受体维生素D受体AGAACANNNTGTTCTAGGTCANNNTGACCTAGGTCANNNNNAGACCAAGGTCATGACCTAGGTCANNNAGGTCAnull5 A 基因组表达的调控机制a 基因组活性的瞬时可逆变化由胞外环境刺激因子介导的信号传递胞外刺激因子跨膜进入细胞后间接影响基因组转录活性：ATP腺苷酸环化酶葡萄糖cAMP启动子CAP 位点null5 A 基因组表达的调控机制a 基因组活性的瞬时可逆变化由胞外环境刺激因子介导的信号转导胞外信号分子 作用于膜受体 后直接激活转录因子影响基 因组转录活性启动子增强子信号分子null胞外信号分子作用于膜受体后通过蛋白级联激活 影响基因组转录活性：PPPPPGDP GTP PPFGF 质膜 核膜 FGFR FRS Grb2 SOS Ras Raf MEKMAPKTFDNA null5 A 基因组表达的调控机制a 基因组活性的瞬时可逆变化由胞外环境刺激因子介导的信号转导胞外信号分子 作用于膜受体 后通过第二信 使分子影响基 因组转录活性启动子增强子信号分子cAMPnull5 A 基因组表达的调控机制b 基因组活性的永久性和半永久性变化基因组表达活性的瞬时变化是可逆的，当环境刺激因子或信号分子消失之后，基因组表达活性可回复至原来的状态。而基因组活性的另一类变化却是半永久性甚至永久性地保持着，导致这类变化的基因组表达调控机制包括：由基因组重排引起的基因组活性改变由染色质结构引起的基因组活性改变由基因组反馈引起的基因组活性改变瞬时可逆变化模式永久半永久变化模式null5 A 基因组表达的调控机制b 基因组活性的永久性和半永久性变化由基因组重排引起的基因组活性改变JJDD由基因组重排获得表达活性的一个典型案例是脊椎动物的免疫球蛋白（抗体）和T淋巴细胞受体（TCR）的多样性表达。人类能表达高达数亿乃至数十亿种不同序列的抗体和TCR，但基因组中的基因总数不超过三万个，那么这么海量的免疫蛋白是如何产生的呢？null5 A 基因组表达的调控机制b 基因组活性的永久性和半永久性变化由基因组重排引起的基因组活性改变123-129 VH27 D9 JH11 CHCH1CH2CH3铰链区可变区编码区信号肽编码区IGH：null由基因组重排引起的基因组活性改变免疫蛋白基因组重排呈随机性，但DNA断裂的位点却相当精确，由RAG催化只有重排了的基因组方能转录。null5 A 基因组表达的调控机制b 基因组活性的永久性和半永久性变化由染色质结构引起的基因组活性改变基因基因基因多梳应答元件 10 kb 5‘-GAAAA-3’多梳蛋白 PCBDSP 背开关蛋白常染色质异染色质组蛋白null5 A 基因组表达的调控机制b 基因组活性的永久性和半永久性变化由基因组反馈引起的基因组活性改变myoD肌动蛋白和肌球蛋白基因MyoD由myoD基因编码的MyoD转录调控因子参与脊椎动物肌肉组织的发育过程，一个细胞若开始表达myoD基因，它便倾向于分化为肌肉细胞MyoD蛋白即可作用于其靶基因的增强子，又能激活自身基因的转录由此构成基因组的正反馈调节。null5 B 基因组转录图谱的绘制a 基因的转录物与转录组单个基因因多重启动子结构或（和）转录产物的选择性剪切往往会产生基因的转录物多条长度和序列不完全相同的mRNA，后者被称为该基因的转录物。P1E1E2P2E3E4E5E6E7E8RNA1RNA2RNA3RNA4null5 B 基因组转录图谱的绘制a 基因的转录物与转录组基因的转录物CaMKIId 基因E13E14E15E16E17dA 蛋白dB 蛋白dC 蛋白null5 B 基因组转录图谱的绘制a 基因的转录物与转录组全基因组在同一种细胞同一时间内所有基因的转录状态被称为转录谱：全基因的转录谱全基因组全基因组转录谱null5 B 基因组转录图谱的绘制a 基因的转录物与转录组肝脏 大脑 血液 神经 心脏 红细胞 噬中粒 噬酸粒 噬碱粒 血小板 G0 期 G1 期G2 期S 期 M 期全基因组在整个生命周期中所有转录谱的集成：全基因的转录组转录组null5 B 基因组转录图谱的绘制a 基因的转录物与转录组值得注意且非常重要的是，转录组中的mRNA并非从头（de novo）合成，通常一个细胞在其通过细胞分裂诞生时便继承了母细胞中的转录组mRNA；也就是说，基因组中各蛋白质编码基因的转录过程并非指全转录组的合成，而是通过增补被降解的部分mRNA来维持全转录组的组成。一般而言，一个基因所对应的mRNA不到细胞内总mRNA量的1%，但极个别种类的mRNA可达总mRNA量的30%，如发育种子中转录组的特性的麸朊蛋白mRNA。null5 B 基因组转录图谱的绘制b 转录组的检测与解析基于序列比对的转录组检测解析转录组检测和解析的最直接方式是将所有的mRNA全部转变为cDNA并一一测序，然后通过将cDNA序列与已知的基因组序列进行比对，便可检测出哪些基因表达的mRNA存在于转录组中。这一战略有两种实验形式：表达序列标签分析（Expressed Sequence tags，EST）和基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）。null5 B 基因组转录图谱的绘制b 转录组的检测与解析基于序列分析比对的转录组检测解析表达序列标签分析技术（EST）表达序列标签分析的思路是对已建好的cDNA库中每个克隆插入的cDNA片段从5’末端或3’末端进行一轮单向自动测序，获得约60-500bp的一段cDNA部分序列即表达序列标签（EST）。TTTTAAAATTTTAAAACCCCGGGGTTTTCCCCTTTTAAAA寡聚脱氧胸苷酸与mRNA退火逆转录TdT增补同聚尾聚合cDNA第二链null5 B 基因组转录图谱的绘制b 转录组的检测与解析基于序列分析比对的转录组检测解析基因表达系列分析（SAGE）技术是从已建好的cDNA库中每个克隆制备12bp的序列，高通量测序，然后与已知的基因组序列进行比对分析，以确定哪些基因转录表BsmF1在其识别序列10-14bp以远处切割cDNA基因表达系列分析技术（SAGE）达，并可根据序列出现的频率定量测定。null5 B 基因组转录图谱的绘制b 转录组的检测与解析基于微阵列或芯片杂交分析的转录组检测解析荧光标记的cDNA样品杂交激光共聚焦扫描检测洗涤红橙黄绿青蓝紫依次表示杂交强度基本程序null5 B 基因组转录图谱的绘制b 转录组的检测与解析基于微阵列或芯片杂交分析的转录组检测解析微列阵DNA芯片每个点阵固定一种cDNA或PCR产物每个点阵固定一个基因的20个不同区域序列定性分析null5 B 基因组转录图谱的绘制b 转录组的检测与解析基于微阵列或芯片杂交分析的转录组检测解析定量分析10 910 910 910 910 910 910 910 910 9远多于任何基因的cDNA拷贝数null5 B 基因组转录图谱的绘制c 模式生物的转录组研究酿酒酵母的转录组酿酒酵母拥有6000多个蛋白质编码基因，是转录组研究最早最重要的模式生物。酿酒酵母转录组研究的两个重要成果包括：胞外环境因素变化显著影响转录组中mRNA成分的波动，例如：环境中葡萄糖充足时，尽管酵母细胞分裂旺盛，但转录组基本恒定环境中葡萄糖枯竭时，1000种mRNA含量降低，700种mRNA升高转录组中一些表达活跃的mRNA源自未知功能的基因，例如：酿酒酵母芽孢生成过程的研究暗示转录组研究有助于标注基因组null5 B 基因组转录图谱的绘制c 模式生物的转录组研究人类的转录组纵坐标为基因组单位长度内外显子和杂交阳性探针即mRNA密度null5 B 基因组转录图谱的绘制c 模式生物的转录组研究人类的转录组纵坐标为基因组单位长度内外显子和杂交阳性探针即mRNA密度null5 B 基因组转录图谱的绘制c 模式生物的转录组研究人类的转录组人类转录组中mRNA的种类数五倍于基因数，这表明大多数人类基因拥有多于一种的转录物。分析整个基因组后发现，大约有一万种mRNA是在先前认为不存在任何基因的DNA区域内被发现的。这充分说明了转录组研究的必要性。null5 C 基因组差异表达的研究 转录组图谱相对于基因组图谱的一个显著优势是其具有动态性。随着细胞生长周期和个体发育阶段的不断推进，基因组的表达谱（即转录谱）将会发生程度不同的差异，这些随时间、空间、物种不同而表现出来的基因转录差异往往能真实地揭示生命运动的规律与本质。因此，基因组差异表达的研究具有重要价值。null5 C 基因组差异表达的研究a 不同物种来源的转录组差异检测物种A转录组物种B转录组将来自两种不同物种的cDNA样品分别用两种荧光基团的胞嘧啶核苷酸C3和C5标记，同时杂交同一DNA芯片，洗去非杂交样品后，用两种不同波长的激光扫描检测芯片，获得两个可比对研究的转录组图nullScience 332, 930, 2011L： 对数期 GD：糖代谢ES：静止期 HS：热休克null5 C 基因组差异表达的研究b 不同时间或区域的转录组差异检测将来自同一物种不同时间的cDNA样品分别杂交相同的微列阵，并将杂交信号的相对强弱（即mRNA的转录水平强度）用颜色表示，由此可以比对分析任意两个基因表达水平之间的相关性，并以树状聚类图的形式表现出来，这种方法称为系统聚类法（Hierarchical clustering）。null5 C 基因组差异表达的研究b 不同时间或区域的转录组差异检测 另一方面，也可以利用报告基因探测法跟踪基因组中一组特定基因的时空表达（转录）特征。决定基因或基因组时空特异性表达的主要因素是存在于基因编码区上游的启动子-增强子序列（基因表达调控的顺式元件）以及存在于特定细胞特定时间的转录调控因子（基因表达调控的反式元件），而非基因编码区本身。因此，可以选取表达产物易于观察检测的某些已知基因（报告基因）的编码区取代待测基因的编码区，由此探查待测基因转录表达的时间和空间差异。null5 C 基因组差异表达的研究b 不同时间或区域的转录组差异检测待查基因报告基因利用同源重组技术 以报告基因取代待查基因null5 C 基因组差异表达的研究c 基因组与转录组之间的差异检测转录组测序还能调查mRNA转录的忠实性。依据经典的中心法则，mRNA的序列应该与其基因的外显子序列完全一致，但事实并非绝对如此。来自27个人B淋巴细胞4741个已知功能基因的10210个外显子中，共检出28766处碱基与mRNA相应位点的碱基不符null5 C 基因组差异表达的研究c 基因组与转录组之间的差异检测nulld 基因的转录组差示克隆多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因 cDNA克隆nulld 基因的转录组差示克隆癌组织癌旁组织总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交癌组织特异性表达的基因 cDNA克隆nulld 基因的转录组差示克隆癌旁组织癌组织总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交癌组织特异性关闭的基因 cDNA克隆功能基因组学：基因组表达基因组表达的调控机制功能基因组学：基因组表达5 A 基因组转录图谱的绘制基因组差异表达的研究5 B 5 C 功能基因组学的一大任务绘制基因组的转录图谱