抗体标记(1) 2

试剂配制： 1、pH5.6醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸钠（甲液）：无水醋酸钠8.20g，加蒸馏水至500ml; 0.2mol/L醋酸（乙液）：无水醋酸5.73ml,加蒸馏水至500ml; 取甲液4.55ml，乙液0.45ml，混匀即可 2、0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液： Na2CO3 0.32g NaHCO3 0.586g 加蒸馏水至50ml 3、0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液： 将0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液稀释20倍即可 4、0.1M高碘酸钠 取X（X≥10） mg的高碘酸钠溶解在47*X ul的蒸馏水中。 5、2.5%的乙二醇 取125ul乙二醇溶解在5ml 双蒸水中 6、5mg/ml的硼氢化钠（NaBH4） 1mg溶于0.2ml的蒸馏水中 抗体 编号 2# 6# 27# 37# 40# 71# 透析后浓度（mg/ml） 2.26 3.48 3.64 4.73 3.16 1.84 体积（ul）（0.2mg） 88.5 57.5 54.9 42.3 63.3 108.7 实验步骤： HRP:RBP4=1:4 HRP:NaIO4=1:0.43 1 取3.5mg的HRP酶溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液3.5ml，至终浓度为1mg/ml； 2 加入70.3ul 0.1M的高碘酸钠（214g/mol），此时溶液由原棕色变为墨绿色，4℃避光反应20-30min； 3 加入2.5%乙二醇140ul， 4℃避光1h终止反应； 4 取适量体积加入相对应的抗体（0.2mg）中，用0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液调PH到9.0-9.5，然后用0.01M CBS透析，4℃过夜； 5 新配NaBH4 5mg/ml，每种抗体加2ul，吹打混匀，4℃，3h； 6 加等体积的饱和硫酸铵，4℃放置2h； 7 离心，7000rpm 4℃ 30min； 8 加少量PBS（200ul)溶解，用PBS透析，换液2-3次 9 取出透析袋中的溶液，离心8000rpm 5min ，去除沉淀，上清液即为酶结合物，测OD280和OD403，计算出酶的含量，最后加甘油保存，推算出终浓度； 2013-11-19 实验设计 项目：RBP4抗体配对（双抗夹心） A-G包被抗体1ug/ml，抗原500ng/ml H包被抗原1ug/ml,做阳性检测标记效果 2# 6# 16# 27# A 2# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 B 6# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 C 16# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 D 27# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 E 37# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 F 40# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 G 71# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 H 阳性 1:500 1:1000 1:3000 1:500 1:1000 1:3000 1:500 1:1000 1:3000 1:500 1:1000 1:3000 37# 40# 71# 阴性 A 2# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 B 6# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 C 16# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 D 27# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 E 37# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 F 40# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 G 71# 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 1ug/ml抗原 H 阳性 1:500 1:1000 1:3000 1:500 1:1000 1:3000 1:500 1:1000 1:3000 1ug/ml抗原