欧蒙抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程

抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程 目的 规范抗核抗体谱(IgG)检测，保证结果的准确性。 适用范围 检验科免疫组工作人员。 试剂规格名称与组成 型号名称：ANA 谱 1 靶抗原：nRNP/Sm，Sm，SS-A，Ro-52，SS-B，Scl-70，Jo-1，CENP B，dsDNA，核小体，组蛋白，核糖体 P 蛋白 类型：IgG 基质：抗原包被的检测膜条 规格：16×01(16) 4.预期用途：用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 nRNP、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P 蛋白和 AMA M2 共 14 种不同抗原 IgG 类抗体。 5.适应症：夏普综合征（MCTD），系统性红斑狼疮（SLE），干燥综合征，进行性系统性硬化 症，多肌炎皮肌炎、重叠综合征、局限型进行性系统性硬化症（CREST 综合征），原发性胆汁 性肝硬化。 6.临床意义：抗核抗体识别是各种细胞核组分（细胞核的生化成份）[1,2]，包含核酸、细胞核蛋白 及核糖蛋白。可特征性地出现于许多疾病中，尤其是风湿性疾病[3,4,5]。在炎症性风湿性疾病 中，这些抗核抗体的阳性率在 20%到 100%之间，以风湿性关节炎的阳性率最低，在 20%至40%之间。因此，ANA 鉴别诊断在对个别风湿疾病的确认十分必要，而且对自身免疫性疾病的进 一步诊断也很有价值。[3,6,7,8,9,10,11] 风湿疾病 —夏普综合征（混合结缔组织病＝MCTD)[8] —系统性红斑狼疮（SLE)[8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22] —干燥综合征（原发性干燥综合征）[5], —系统性硬化症（系统性硬皮病,SSc)[1, 23], —局限型系统性硬化症（CREST 综合征） [28] —多肌炎/皮肌炎[12,15] —类风湿性关节炎[5] 7.主要组成成分： 成份 规格 规格 1. 包被抗原的检测膜条：nRNP/Sm、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM- Scl 、Jo-1 、CENP B 、PCNA 、dsDNA 、核小 体、组蛋白、核糖体 P 蛋白、AMA M2。 16 条 4x16 条 STRIPS 2. 阳性对照 人 IgG，100 倍浓缩 1x0.02ml 4x0.02ml POS CONTROL 100x 3. 酶结合物 碱性磷酸酶标记的羊抗人 IgG，10 倍浓缩 1x3ml 4x3ml CONJUGATE 10x 4. 样本缓冲液 直接使用 1x100ml 3x100ml SAMPLE BUFFER 5. 清洗缓冲液 10 倍浓缩 1x 50 ml 1x 100 ml WASH BUFFER 10x 6. 底物液 NBT/BCIP（四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲 哚-磷酸盐），直接使用 1×30ml 4×30ml SUBSTRATE 7. 温育盘 2x8 槽 --- 8. 产品说明书 1 份 1 份 LOT 试剂批号 储存温度 IVD 体外检测 未开封可稳定至 8.储存条件及有效期： 2-8°C 保存，不要冷冻。未开封前，除非特别说明，试剂盒自生产日起可稳定 18 个月。稀释后的酶结合物和清洗缓冲液需在一个工作日内用完。 9.样本要求 样本：人血清或 EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝的血浆。 稳定性：待检患者样本于 2-8°C 可稳定 14 天，稀释后的样本应在同一个工作日内检测。 样本稀释： 患者样本用样本缓冲液 1:101 稀释，如可取 15ul 血清用 1.5ml 样本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀。不可用加样器混匀。 10.检验方法 10.1试剂的准备和稳定性 注意：使用前所有试剂均必须于室温（18-25°C）平衡 30 分钟。从第一次使用起，试剂盒如保存 在 2-8°C，并且在没有污染的情况下，可稳定至所标示的有效期。 - 包被抗原的检测膜条：直接使用。为防止膜条发生冷凝，只有当膜条平衡到室温后才可打开包装。取出膜条后应立即密封好原包装并将其保存于 2-8°C。 - 阳性对照：100 倍浓缩。使用时用干净的吸管从瓶中吸取所需阳性对照，用样本缓冲液 1:101 稀释如：15ul 阳性对照用 1.5ml 样本缓冲液稀释并充分混匀。已稀释的阳性对照应在同一个工作日用完。 - 酶结合物：10 倍浓缩。使用时用干净的吸管从瓶中吸取所需酶结合物，并用样本缓冲液 1:10 稀释。如需温育一条检测膜条，用 1.35 ml 样本缓冲液稀释 0.15 ml 酶结合物。已稀释的酶结合物应在同一个工作日用完。 - 样本缓冲液：直接使用。 - 清洗缓冲液：10 倍浓缩。使用时用干净的吸管从瓶中吸取需要量用蒸馏水 1:10 稀释。如需温育一条膜条，用 9ml 蒸馏水稀释 1ml 浓缩缓冲液。稀释后的缓冲液应在同一个工作日用完。 - 底物液：直接使用，对光敏感，使用后应立即盖紧瓶盖。 10.2操作流程 预处理:取出所需的膜条，将其放入温育槽内。膜条上有编号的一面朝上。在温育槽中分 别加入 1.5ml 样本缓冲液，于室温在摇摆摇床上温育 5 分钟后，吸去温育槽中的液体。 血清温育第一次: 在温育槽中分别加入 1.5 ml 已稀释的血清样本，在摇摆摇床上室温（18°C- 25°C）温育 30 分钟。 清洗: 吸去槽内液体，在摇摆摇床上用 1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条 3 次，每次 5 分钟。 酶结合物温育第二次: 在温育槽中加入 1.5ml 已稀释的酶结合物（碱性磷酸酶标记的抗人 IgG），于摇 摆摇床上室温温育 30 分钟。 清洗: 吸去槽内液体，在摇摆摇床上用 1.5ml 清洗缓冲液清洗膜条 3 次，每次 5 分钟。 底物温育第三次: 在温育槽中分别加入 1.5ml 底物液，于摇摆摇床上室温（18°C-25°C）温育 10 分钟。 终止: 吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条 3 次，每次 1 分钟。 结果判断: 将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。 在欧蒙印迹法自动操作仪（EUROBlotMaster）中使用该产品时，请选择方法列表中的 Euro01AAb EL30。 抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒（欧蒙印迹法）实验操作 11.参考范围： 检测 50 例健康献血员血清的中 ANA 谱水平，结果显示：所有献血员均为阴性。 12：检测结果的解释 方法：对已温育的检测膜条，我们推荐使用 EUROLineScan 软件评价结果。采用去离子水或者蒸馏水终止反应后，用镊子将检测膜条放在绿色纸的粘性塑料膜上。当膜条还是湿的时候，可以调整位置。当把膜条置于结果判定模板中的塑料膜上，并与标志对齐，用力按压，膜条完全干后 将粘附于塑料膜上。干透后的检测膜条，可用台式扫描仪(EUROIMMUN AG) 扫描，并采用 EUROLineScan 软件评价结果。关于 EUROLineScan 程序的相关信息，请参照 EUROLineScan 使用手册(EUROIMMUN AG)。该检测膜条相应的Test 代码是 Ana3b。 如果您需要进行目测,可以从欧蒙公司订购结果判定模板（订货号：ZD 1590-0101-3G） 。 检测膜条上有一条质控带，如果质控带出现强的颜色反应说明实验操作正确。膜条包被抗原的位置上出现的白色条带应判为阴性。 抗原及其在检测膜条上的位置：DL 1590-3G 欧蒙印迹法检测膜条包被有如下抗原： nRNP/Sm：小牛和兔胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然 U1-nRNP。 Sm：牛脾脏和胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然 Sm。 SS-A：牛脾脏和胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然 SS-A。 Ro-52：重组的 Ro-52（52kDa），相应的人 cDNA 用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达。 SS-B：小牛和兔胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然 SS-B。 Scl-70：牛和兔胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然 Scl-70（DNA 拓扑异构酶 1）。 PM-Scl：重组抗原，相应的人 cDNA 用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达。 Jo-1：小牛和兔胸腺提取物，经亲和层析纯化的天然 Jo-1（组氨酰-tRNA 合成酶）。 CENP B：重组的着丝点蛋白 B，相应的人 cDNA 用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达。 PCNA：重组的 PCNA（36kDa），相应的人 cDNA 用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达。 dsDNA：从鲑鱼睾丸提取物中高度纯化的天然双链 DNA。 核小体：从牛胸腺提取物中纯化的天然核小体。 组蛋白：从牛胸腺提取物中纯化的各种类型组蛋白的混合物。 核糖体 P 蛋白：小牛和兔胸腺提取物，用亲和层析纯化的天然核糖体 P 蛋白。 AMA M2：从猪心脏提取物中纯化的天然 M2 抗原（丙酮酸脱氢酶复合物）。 根据抗原带着色的深浅，可将结果分为阴性、可疑和阳性。 抗原带着色的深浅 结果 无色 阴性 着色非常弱 可疑 着色中到较强 阳性 着色与质控带强度相同 强阳性 根据 EUROLineScan 判读结果，可将结果分为阴性、可疑和阳性。 等级 EUROLineScan 着色强度 结果 o 0 - 5 阴性 (+) 6 - 10 可疑 + 11 - 25 弱阳性 ++ 26 - 50 阳性 +++ 51 - 256 强阳性 用欧蒙印迹法检测自身抗体时，应同时采用间接免疫荧光法实验。这样一方面可确保结果的可靠性，排除假阳性反应；另一方面，欧蒙 HEp-2 细胞，特别是 HEp-2 细胞与灵长类肝冰冻组织切片的生物薄片马赛克的间接免疫荧光法可检测抗核抗体的范围非常广，而欧蒙印迹法检测膜条上的抗原种类非常有限，只能检测有限的抗体。 13.产品性能指标 13.1定标：检测膜条上各种抗原的反应性已用疾病控制中心（美国亚特兰大）提供的人参考血清 这些 CDC 血清的特异性已用免疫荧光模型（基质：HEp-2 细胞和灵长类肝脏）、双向免疫扩散或对流免疫电泳的结果进行验证，这些血清不是单一特异性的。 13.2检测范围：欧蒙印迹法为定性检测方法，没有检测范围，样本稀释度为 1:101。 13.3交叉反应：高质量抗原（抗原和抗原的来源）确保了检测系统的高特异性。本欧蒙印迹法检测试 剂可特异检测IgG 类抗nRNP/Sm 、Sm 、SS-A 、Ro-52 、SS-B 、PM-Scl 、Jo-1 、CENP B 、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA M2抗体，未发现与其它自身抗体之间的交叉反应。 13.4干扰：血红蛋白浓度小于 5 mg/ml 的溶血、甘油三脂浓度小于 20mg/ml 的脂血和胆红素浓度小于0.4ml/ml 的黄疸对检测结果没有影响。 13.5批内和批间差异：通过比较同一样本在相同时间内多次检测结果的差异来研究批内差异；批批差异为用不同批号产品对同一样本进行检测所得的差异。每一次实验，抗原带着色的深浅都在额定 范围内。该欧蒙印迹法试剂具有很好的批内和批间重复性。 14.注意事项 14.1警示：(1) 本检测试剂仅用于体外诊断。 (2) 质控血清的 HBsAg、抗 HCV、HIV-1 和 HIV-2 抗体均为阴性。但是，试剂盒中所有组分都应视作潜在的传染源小心处理。其中部分试剂（缓冲液、底物液）有毒性，应避免接触皮肤。 14.2废物处理：患者样本、质控血清和温育过的检测膜条应视作传染源处理，其它试剂如果没有特殊规定不需单独处理。