PCR-焦磷酸测序法快速鉴定副溶血性弧菌

PCR-焦磷酸测序法快速鉴定副溶血性弧菌 通过短片段基因序列测定检测副溶血性弧菌。方法 通过对副溶血性弧菌pR72H基因保守片段的焦磷酸测序，达到鉴定副溶血性弧菌的目的。结果 通过焦磷酸测序对pR72H基因上的18bp的保守片段进行测定可准确检测56株副溶血性弧菌。结论 建立的方法具有准确、快速和实时检测等优点，适于对pH72R的快速、高通量检测。 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种革兰阴性嗜盐杆菌，是引起食源性疾病的重要病原之一。该菌主要分布于沿岸海水、海河交界处及海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。它在海产品上的带菌率高达45.7%[1]，其生长速度是一般细菌(如大肠埃希菌、沙门菌等)的2倍，因而更易于引起食物中毒。患者以沿海地区居多, 是食品检验的必检项目。 焦磷酸测序技术是近几年发明的一种实时DNA序列分析技术，以快速、准确、实时分析DNA 序列见长。该技术的发明，使得快速、准确、实时地进行短DNA 序列分析成为可能。自该技术发明以来，已广泛应用于SNP分析，细菌、真菌和病毒的分型、突变位点的检测等[2～5]。在微生物的检测中也得到广泛的应用，但常见报道为应用16S rRNA基因为目的基因，选取其中的变异区进行引物设计和测序，但由于16S rRNA检测容易污染，常导致结果的不准确。本研究针对VP菌的保守基因pR72H的一段保守片段设计引物，通过焦磷酸测序法检测其保守片段，建立了VP的焦磷酸测序检测方法，现汇报如下。 1材料与方法 1.1菌株 研究用56株VP分离菌株均来自2005-2009年的食源性疾病检测，均经API 20E微生物生化鉴定系统鉴定，由本中心菌毒种保藏室提供。菌株ATCC17802由河北省疾病预防控制中心赠与。阴性对照菌株沙门菌（H9812）、阪崎肠杆菌（45301）、普通变形杆菌（49100）、奇异变形杆菌（49106）、小肠结肠炎耶尔森菌（52302）、单增李斯特菌（54003）、大肠埃希菌（8099）、弗劳地柠檬酸杆菌（48014）、铜绿假单胞菌（ATCC15442）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、痢疾志贺菌（51080）、福氏志贺菌（51079）、鲍氏志贺菌（51189）等标准菌株购自中国药品生物制品检定所；宋内志贺菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、假结核耶尔森菌、无害李斯特菌、蜡样芽 孢杆菌、雷氏普罗威登斯菌等为本中心的分离株；海蛹弧菌（1.1623）、需钠弧菌（1.1619）、韦式弧菌（1.1612）、河流弧菌（1.1608）、创伤弧菌（1.1758）、解蛋白弧菌（1.1833）等标准菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 1.2 仪器和试剂 GoTaq Master Mix（Promega公司），Pyro Gold Reagents（瑞典Biotage公司），PCR System 9700型（美国PE公司），PyroMark ID检测系统（瑞典Biotage公司）。 1.3 引物设计 载NCBI基因文库公布的各种细菌的pR72H基因序列60条，以DNAMAN软件进行序列比对，查找VP菌的保守片段，利用PyroMark ID检测系统的Assay Design软件以L30116.1序列为，针对保守序列设计焦磷酸测序的PCR扩增引物和测序引物。上游引物（391 - 413 bp）：5’- AAAGGATACGCTTTAAAACACCG-3’（23bp）, 生物素标记5’端；下游引物（535 - 516bp）：5’- GAAGTAGCCCGAATCCTTGA -3’（20bp）； 扩增片段长度145bp；测序引物（518 – 501bp）：5’- TGAACATACGCAGCTAAT -3’(18bp)。 1.4 DNA模板的制备 将各菌株复苏后划线接种各自选择性平板，过夜培养，用10μL吸头挑取1~3个细菌克隆悬于50μl 1×TE溶液（pH8.0）中，在管壁适当研磨，震荡混匀，短暂离心，沸水浴5min，冷却至室温，12000rpm离心5min，取上清，分装保存于-20℃作为DNA模板。 1.5 PCR扩增 PCR反应体系50μl: 2×GoTaq Master Mix 25μl，上游引物和下游引物各10pmol，DNA模板 2μl，加无菌去离子水至50μl。扩增反应参数：94℃ 预变性5min，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环，72℃延伸5min。取反应产物5μl上样，QIAxcel全自动DNA/RNA分析系统观察结果。 1.6 单链模板制备 将PCR产物25μl转移至加有Sepharose beads 3μl和Binding Buffer 47μl的 96孔PCR板中, 常温混匀10min。打开真空泵，依次将Vacuum Prep Tool在超纯水中清洗30s、在96孔PCR板中抓取Sepharose beads，随后分别在70%乙醇、Denaturation Buffer、Washing Buffer中清洗5~10s，再将其放入预先加入0.3μmol/L测序引物和Annealing Buffer（共45μl）的PSQ96孔板中充分震荡摇动释放Sepharose beads。 1.7 焦磷酸测序分析 将放有样品的PSQ96孔板80℃孵育2min，冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。将酶混合物、底物混合物和四类核苷酸(A、T、C和G)分别加入试剂舱固定位置。设定程序，将试剂舱和PSQ96孔板放入机箱中进行测序反应。 2 结果 2.1 PCR扩增结果 利用设计引物扩增各菌株的特异基因片段，仅见VP扩增出长度为145bp的目的片段，其他非VP菌的对照菌均无扩增条带出现，不再进行焦磷酸测序检测。 注：A01：分子量标准；A02~A12：部分VP菌PCR扩增结果 图1 部分VP菌PCR扩增结果 2.2 焦磷酸测序结果 按照10（TCGA）碱基顺序加入程序进行焦磷酸测序，可很好测得每个菌株的目的片段序列CTGCACTTACAAACAGTT，经NCBI的在线BLAST分析确证为VP的pR72H基因片段，测序结果完全正确。后经在线BLAST分析发现CTGCACTTACAAACAGTT18个碱基的一段序列即可达到对VP的鉴定目的。本实验随后又采用固定碱基加入序列（CTGCACTACACAGT）的方法进行了焦磷酸测序检测，结果与 3 讨论 由于副溶血弧菌引起的食源性疾病严重影响了食品公共安全，对其快速鉴定有着重要的意义。在众多的方法中，DNA序列测定被认为是鉴定病原菌的黄金标准。尽管有文献报道[7]，经典的Sanger DNA测序方法可以实现高度自动化，但是当所需DNA片段较短时，该方法比焦磷酸测序技术不仅耗时长，而且费用高，操作复杂。焦磷酸测序技术是短核苷酸序列实时测定的一种新方法，该方法既可以用于已知突变序列的验证性测序，也可以用于未知序列探索性测序[8～10]。该方法不仅具有Sanger测序法的高精确性，还具有高通量、高自动化、高效、简单易行、省时省力等其它检测技术不可比拟的优点。 本实验将焦磷酸测序技术用于VP的快速检测，通过针对保守基因pR72H的一段保守片段进行测序，建立了一种新的用于鉴定VP的分子诊断方法。该方法特异性高，仅VP菌能得到很好的测序结果，其他非VP菌在PCR扩增阶段由于没有得到目的条带而得到排除。通过焦磷酸测序对PCR扩增结果进行分子水平的验证, 避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高。 本研究采用优化的焦磷酸测序反应体系进行DNA序列测定，测序结果经NCBI的在线BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，显示CTGCACTTACAAACAGTT18个碱基就可达到鉴定VP的目的；同时对实验结果峰图分析发现，其信号清晰，分辨率高，信号强度与核苷酸一致不需标准品对照，可由相关软件进行分析判断，在一定的程度上避免了主观因素带来的误差。另外在本实验中采用固定碱基序列的方法后对VP的检测仅在20分钟内就可完成，检测结果实时。本实验还进行了重复测序，结果证明符合率达到100%。 综上所述，本实验所建立的PCR-焦磷酸测序检测VP的方法体现了该方法准确性高、重复性好、高度自动化、低成本、高灵敏度、可一次性检测96份样品的高通量的优点，使之有望成为一种快速检测病原菌的技术。