副溶血弧菌毒力基因和保守基因研究进展

副溶血弧菌毒力基因和保守基因研究进展 对副溶血弧菌的毒力基因及其保守基因的研究现状进行综述，可从分子水平对鉴定副溶血性弧菌和确定菌株的毒力提供参考。 副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐性革兰阴性菌，属于弧菌科中的弧菌属，是一种食源性致病菌，主要来源于虾、贝类等海产品。该菌可引起人腹泻、恶心、发烧等典型的胃肠炎反应及食物中毒。随着分子生物学技术的发展和VP全基因组序列测定的完成，使得人们对VP的毒力基因和保守基因序列有了更深入的了解。为了从分子水平对鉴定VP和确定菌株的毒力提供参考，对VP的毒力基因和保守基因研究现状进行综述。 1 VP的毒力基因 1.1 耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin, tdh) tdh编码TDH蛋白，TDH是VP重要的致病因子，分子量为42kDa，等电点为4-5，可现出溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性等生物学活性。Nishibuchi等[1]通过把tdh基因亚克隆于大肠埃希菌研究发现tdh基因位于1.3kb的HindⅢ片段上，经过对该片段的测序发现，该基因编码一条由165个氨基酸残基组成的成熟蛋白，蛋白序列前24个氨基酸是信号肽序列；又对表型变种和携带tdh基因的VP菌株的核酸序列变种之间的关系进行了审查，结果发现典型的KP阳性菌株携带有tdhl和tdh2 2个染色体基因拷贝，两者的同源性为97.2%，而呈现溶血弱阳性或阴性tdh株只携带1个染色体基因拷贝。将由核酸序列推测的氨基酸序列与tdh1缺失的溶血阳性的菌株经过Edman降解法后得到的蛋白序列比较发现tdh2对溶血现象起主要的作用。另外，从表型阴性株中还克隆到其他2个基因拷贝，这些株当中，除了染色体上有1个单拷贝tdh3外，质粒中也包含有1个基因拷贝tdh4。这2个基因都可以在大肠埃希菌中表达并产生具有溶血活性的TDH。tdh的表达受操纵子ToxRS的调节，该操纵子的过量表达可以使tdh1、tdh2、tdh3、tdh4的表达提高至原来的1.25倍、5.07倍、3.9倍、11.0倍，然而可能由于它们本身启动子基本表达水平上的不同，在VP-ToxR调控下的tdh1、tdh3、tdh4基因产生的TDH溶血素水平仍低于在没有VP-ToxRS的调控下的tdh2基因，因此ToxRS的表达对tdh2的影响更大[3]。Baba等[4]用HindⅢ消化副溶血弧菌AQ3860的染色体DNA发现1.0kb HindⅢ片段上还含有1种类似tdh的基因序列，即tdh5。tdhl与tdh2、tdh3、tdh4、tdh5相似率分别达97.2%, 96.7%, 96.7%和96.7%，因此tdh基因的保守序列可以用来作为VP的目的基因，但是由于它与其他可产生该毒素的非副溶血性弧菌具有很高的同源性，应用其进行PCR检测VP就存在一定的局限。 1.2 相对耐热直接溶血毒素基因(TDH related hemolysin, trh) 1987年Honda[5]发现了一种毒素具有与TDH相似的免疫原性，抗原性有部分交叉，因此命名为TDH相关溶血素-TRH。Shirai等[6]用trh探针和tdh探针检验了214株Vp临床分离的菌株，结果表明112株（52.3%）仅携带tdh基因、52株(24.3%)仅携带trh基因，24株（11.2%）同时携带tdh、trh基因；对环境分离株检测结果表明，大多数环境样品分离株都不携带tdh和trh基因。这些结论表明TRH是VP的另一个重要的毒力因子。TRH由trh基因编码，具有溶血作用和肠毒素作用，其分子量为48kDa，等电点为4.6，但TRH不耐热，在60℃以上10min即可灭活。编码TRH 、TDH这两种毒素的基因trh和tdh的核苷酸序列的同源性较高，trh与tdh1的同源性达68.4%，与tdh2的同源性达68.6%[7]，并且由于trh基因和tdh基因一样都不是单一基因，如以trh作为检测VP的目的基因，易出现假阳性结果。 1.3 不耐热溶血素基因(thermolabile hemolysin, tlh) TLH是近年来研究发现的另一种溶血毒素，由tlh基因编码，tlh基因位于染色体上，长约1.3kb。Taniguchi等[8]由 tlh基因的核苷酸序列研究发现前蛋白和成熟蛋白分别含有418个氨基酸和398个氨基酸，分子量分别为47.5kDa和45.3kDa。TLH是一种非典型的磷脂酶(phospholipase, PLase)，本身并没有直接溶血活性。PLase分为PLaseA和PLaseB两种。PLaseA只能水解磷脂酰胆碱（PC）或溶血卵磷脂（LPC）中的一种，而PLaseB能水解PC和LPC。一种认为TLH可以将PC水解成LPC，然后再将LPC水解成甘油磷酰胆碱（GPC），而LPC才具有溶血活性，TLH应属于PlaseB。然而根据溶血活性，TLH又可归为plaseA或溶血磷脂酶。因此TLH在VP中的功能和致病性尚不十分清楚。由于tlh基因具有种属特异性，无论是临床分离株还是环境分离株都含有tlh基因[9]，因此对VP的检测具有很强的实用性。但是Robert pillot等[10]研究发现，副溶血弧菌与溶藻弧菌tlh 基因的同源性达60%~70%，因此仅靶定tlh基因并不能区分二者。 1.4 尿素酶基因簇（Ure基因簇） Ure基因簇编码尿素酶，Ure基因簇包含有8个结构基因[11]，即UreD、A、B、C、E、F、G和UreR。UreR基因位于Ure上游5.2kb处，与其他7个基因方向相反。编码尿毒酶亚单位的UreA、UreB和UreC上游紧邻的是编码监护蛋白的UreD，下游则是编码吸收镍离子进入脱辅基酶蛋白的附属基因UreE、UreF和UreG。UreC基因是尿素酶基因中最稳定的结构基因。尿素酶的分子量为275KDa，其等电点为5.2。组成尿素酶的3个亚单位的分子量分别为85KDa、59KDa、和33KDa。Cai Y等[12]通过对纯化的尿素酶研究发现其可以引起乳鼠肠液的积聚，表明尿素酶是细菌致病性的另一个重要的致病因子。Suthuenkul等[13]通过对临床分离株VP研究发现所有的尿素酶阳性菌都含有trh基因，相反尿素酶阴性菌都不携带此基因。同时Iida等[7]通过基因组分析发现，Ure和trh基因都位于小的复制子上，且两者的基因序列位于染色体DNA相邻的编码区，通过长距和精确PCR（LA-PCR）测得Ure和trh基因之间的距离小于8.5 kb。又通过PFGE对VP染色体DNA上Ure和trh之间的相对位置关系进行分析，表明Ure和trh在同一NotⅠ片段上，并且集中在染色体DNA的一小部分内，因此，Ure和trh基因在VP菌株中存在遗传学上的联系。但另有研究发现尿素酶或者尿素酶基因簇并不会抑制tdh和trh的表达。总之，尿素酶可以作为检测VP，尤其是KP阴性的一个生物学标志。 1.5 Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system，TTSS ）基因簇 细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重要进展，其中的TTSS与革兰阴性病原菌毒力因子的分泌有关，在病原菌与宿主细胞接触后，这一系统得以启动，具有接触介导的特征。启动后细菌分泌与毒力有关的多种蛋白质，与相应的伴侣蛋白结合，从细菌的胞浆直接进入宿主细胞胞浆，发挥毒性作用。编码TTSS蛋白的基因通常位于细菌基因组上毒力岛和毒力质粒上，并成簇存在，约有20~30个，在不同的细菌上表现出种属特异性。Makino等[14]通过用全基因组鸟枪法对副溶血弧菌临床株RIMD2210633的测序研究中首次发现TTSS由位于染色体1和2上的TTSS1及TTSS2两个基因簇构成，分别与细菌对机体的细胞毒性和肠毒性有关，其中TTSS2基因簇位于致病岛上tdh的两个拷贝之间，且只在KP阳性的致病菌株中存在，而环境菌株中不存在。另外研究发现TTSS的致病机理是通过接触依赖性转运将底物蛋白转运到真核细胞内。 2. VP的保守基因 由于毒力基因只能鉴定致病性的VP,确定VP的毒力，用于鉴定VP则会出现假阴性结果。而细菌的保守基因具种特异性，可以用于细菌种的鉴定，选择合适的保守基因对快速筛选VP具有重要的意义。 2.1 gyrB基因 gyrB基因存在于多数的细菌中，但不同种属的细菌则存在一个或多个位点的变异。Venkateswaran等[15]以VP的编码DNA促旋酶B亚单位的gyrB为靶基因寡核苷酸引物，扩增长度为285bp，特异性试验证明该引物对全部117株VP都存在285bp的特异性扩增片段，而90株其他弧菌和60株非弧菌都没有特异性扩增。因此，gyrB基因具有VP种特异性，而且该基因为单拷贝基因，具有设计PCR引物的保守区域。 2.2 pR72H基因 pR72H基因的DNA序列是由一个非编码区和磷脂酰丝氨酸合 成酶基因组成，并且具有VP的高度保守序列。Lee[16]等克隆了93号VP染色体的0.76-Kb的HindⅢDNA片段，此DNA片段被认为pR72H片段，尽管此片段的功能仍不是很清楚，但实验结果显示pR72H基因几乎存在于所有的VP中，可以用于VP的种特异性检测。随后又对pR72H基因进行了测序，并基于此序列设计引物VP33和VP32，对124株VP及50株非VP菌株进行了PCR检测，结果显示特异性可达100%[17]。 2.3 ORF8基因 1996年在东南亚等一些地方发现了引起的腹泻的O3:K6血清 型的VP菌株[18]，尽管细菌的很多血清型都能引起感染，但研究认为O3:K6血清型是这些地区引起疾病的主要菌型。为了在分子水平表明导致其致病的原因，Nasu[19]等研究发现含有开放式阅读框ORF8的丝状噬菌体与VP-O3:K6有关。而Iida[20]等研究表明丝状噬菌体不仅与O3:K6血清型有关，而且还与最新出现的血清型VP有关，对55株菌株进行脉冲场凝胶电泳显示与O3:K6菌株密切相关的菌株96%以上是ORF8基因的阳性菌株。另外研究还表明对O3:K6血清型VP菌株的鉴定，ORF8基因是一个有用的遗传标记。尽管ORF8基因的功能需要进一步的研究，但结果显示其为VP的一个新的致病因素。 2.4 toxR基因 toxR基因编码跨膜转录激活蛋白，在弧菌属中普遍存在，最先是在霍乱弧菌中发现，由它编码的跨膜转录调控蛋白TOXR参与调控霍乱弧菌的一些主要毒力基因和外膜蛋白的表达。随后toxR基因在VP等其他弧菌中发现。因此toxR基因在弧菌属中普遍存在，其可变区可作为检测弧菌不同种的靶位点，toxR基因中存在一个膜栓系区(membrane tether region)，该区的序列在弧菌各种之间呈现出巨大的差异性，是弧菌菌种鉴定的良好分子靶位点。Lin等[21]的研究发现，在副溶血弧菌中存在toxRS（toxR和toxS）基因，并与霍乱弧菌中toxR和toxS的序列相似性分别为52%和62%。并且在临床与环境中的副溶血弧菌都检测发现存在toxRS基因。在toxS存在的情况下，toxR能促进tdh2基因的表达。在tdh2上游144bp的DNA序列对tdh2基因的表达促进作用具有重要作用。在Lin的研究中，以AQ3815（KP阳性菌株）为研究对象，通过诱导toxR缺失突变株，发现toxR对tdh基因的促进表达作用随培养条件的不同而程度不同，用KP肉汤(2%peptone,0.5%NaCI,0.03M KH2PO4,PH6.2)促进作用最强，且对tdh基因的表达促进作用是在转录水平，而toxR对于AQ3815对兔的肠毒素作用是必须的。Kim等[22]建立了一种检测VP-toxR基因的PCR方法，可在种的水平上检测VP；Croci等[23]也证实该基因能特异检测VP。 3. 结语 到目前为止，VP的毒力基因和保守基因的研究已深入到分子领域，并且取得了一些成果，尤其在对溶血素基因的研究方面。然而其他一些毒力基因和保守基因的研究仍然不是很清楚，如pR72H基因和ORF8基因，尚有待于做进一步的研究。另外选择以毒力基因或保守基因作为鉴定VP的靶基因时，应该清楚的认识到检测存在的局限性。目前有多篇文献报道仅以毒力基因的存在与否来确定VP的检出与否，势必会造成假阴性结果。本文通过对VP的毒力基因、保守基因的研究进展进行综述，为便于从分子水平对VP进行鉴定和确定毒力提供参考。