湿热灭菌

null 湿热灭菌工艺的生物学验证 湿热灭菌工艺的生物学验证 2009.08null本部分主要从以下四个方面对湿热灭菌工艺的微生物学验证进行介绍： 1.法规对无菌制剂湿热灭菌工艺验证的要求； 2.微生物的基本知识； 3.微生物灭菌的专业知识； 4.湿热灭菌工艺的微生物学验证； 一、法规对无菌制剂湿热灭菌 工艺验证的要求 一、法规对无菌制剂湿热灭菌 工艺验证的要求新版GMP（欧盟GMP）：新版GMP（欧盟GMP）：第一条 无菌药品是指法定药品中列有无菌检查项目的制剂和原料药，包括非经肠道制剂、无菌的软膏剂、眼膏剂、混悬剂、乳剂及滴眼剂等。 第二章 原则 第四条 无菌药品的生产必须满足其质量和预定用途的要求，最大限度降低微生物、各种微粒和热原的污染。生产人员的技能、所接受的培训及其工作态度是达到上述目标的关键因素，无菌药品的生产必须严格按照精心设计并经验证的方法及规程进行，产品的无菌或其他质量特性绝不能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验。 第五条 无菌药品按生产工艺可分为两类：采用最终灭菌工艺的为最终灭菌产品；部分或全部工序采用无菌生产工艺的为非最终灭菌产品。新版GMP（欧盟GMP）：新版GMP（欧盟GMP）：第十二章 最终灭菌 热力灭菌 热力灭菌通常有湿热灭菌和干热灭菌。 第七十三条 在验证和生产过程中，用于监测或的温度探头与用于控制的温度探头应分别设置，设置的位置应通过验证确定，每次灭菌均应记录灭菌过程的时间/温度曲线。 如采用自控和监测系统，该系统应经过验证，以确保符合关键工艺的要求。该系统应能记录系统本身以及工艺运行过程中出现的故障，操作人员应监控这类故障的发生。应定期将独立的温度显示器的读数与灭菌过程中记录获得的图谱对照 新版GMP（欧盟GMP）：新版GMP（欧盟GMP）：第七十四条 可使用化学或生物指示剂监控灭菌工艺，但他们不得替代物理测试。 第七十五条 灭菌时间应从能保证所有被灭菌品都达到设定的灭菌温度后才开始计算。每种装载方式所需升温时间均须测定并记录。 第七十六条 应有措施防止灭菌冷却过程中已灭菌物品遭受污染，任何与产品相接触的冷却用介质（液体或气体）应经过灭菌或除菌处理，除非能证明生产过程中可剔除任何渗漏的产品。新版GMP（欧盟GMP）：新版GMP（欧盟GMP）：湿热灭菌 第七十七条 湿热灭菌工艺监控的参数应包括灭菌温度、时间和压力。 对腔室底部装有排水口的灭菌柜而言，可能需要测定并记录该点在灭菌全过程中的温度数据。如灭菌工艺中包括抽真空操作，则应经常对腔室作检漏测试。 第七十八条 被灭菌物品如不密封容器中的产品，则应用合适的材料将其适当包扎，所用材料及包扎方式应有利于空气排放，蒸汽穿透并在灭菌后能防止污染。在规定的温度和时间内，被灭菌物品所有部位均应与灭菌介质充分接触。新版GMP（欧盟GMP）：新版GMP（欧盟GMP）：第七十九条 直接接触产品的包装容器、灌装设备、胶塞及可能与产品接触的工器具等的灭菌应采用纯蒸汽灭菌。二、微生物的基本知识二、微生物的基本知识null什么是微生物？ 微生物（microorganism，microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻），属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。微生物的特点微生物的特点1.种类多、分布广； 2.迄今为止，我们知道的微生物约有10万种，目前已知的种类只占地球上实际存在的微生物总数的20%； 3.个体小、面积大； 4.物体的表面积和体积之比称为比表面积，大肠杆菌的比表面积是人的30万倍； 5.吸收多、转化快； 如大肠杆菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身重量2000倍的糖，而人体则需要40年之久。 6.适应强、易变异。微生物的类群和形态结构：微生物的类群和形态结构：微生物按其结构、化学组成及生活习性等分为三大类： 原核细胞型：细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体等； 真核细胞型：真菌； 非细胞型：病毒 噬菌体。细菌的繁殖：细菌的繁殖：二分分裂繁殖是细菌最普遍、最主要的繁殖方式。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横膈膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个字细胞。霉菌霉菌霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见得绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。 霉菌分有性繁殖和无性繁殖两种以无性繁殖为主。病毒病毒病毒的形态基本归纳为三种：杆状、球状和这两种形态结合的复合型。没有细胞构造，病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白质，在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核算蛋白装配的形式进行增殖。病毒粒子通常形成螺旋对称、二十面体对称和复合对称。 病毒只有在宿主细胞里才能进行繁殖，而且是通过复制的方式进行的。概括起来可分为吸附、侵入、脱壳生物合成、装配与释放五个步骤。概念概念“无菌”从定义上来说是一个绝对的概念，但遗憾的是，在科学和技术高度发展的今天，药品的绝对无菌是做不到的，也无法加以证实。然而，无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。FDA、欧洲制药工业界曾将百万分之一微生物污染率作为灭菌产品“无菌”的相对标准，它和蒸汽灭菌后产品中微生物存活的概率为10-6（即产品的无菌保证值为6），系同一标准的不同表示法。这一标准于1980起收录于USP中，如今已为世界各国普遍接受和采用。三、微生物灭菌的专业知识三、微生物灭菌的专业知识无菌保证工艺无菌保证工艺无菌保证工艺即使产品达到规定的无菌保证水平的工艺过程。无菌保证工艺可分为两大类：最终灭菌工艺（terminal sterilization process）和非最终灭菌生产工艺(aseptic processing). 最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行灭菌，以杀灭产品中的微生物的工艺。由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌药品。我国和国际主要药典规定通过最终灭菌使这类药品中污染的微生物残存概率下降至不高于10-6的水平，以SAL≤ 10-6表示。应通过灭菌工艺验证确认已灭菌产品的无菌保证水平。无菌保证工艺（续）：无菌保证工艺（续）：非最终灭菌工艺系指在无菌环境条件下通过无菌操作生产无菌产品的方法。具体就是将组成药品的原料和包装材料分别灭菌或除菌处理，在无菌条件下将其组装成成品的工艺。经该工艺生产的无菌制剂成为非最终灭菌的无菌药品。世界卫生组织、欧盟以及美国FDA等对非最终灭菌的无菌药品的无菌保证水平分别作出了规定。目前WHO、欧盟和我国新版GMP执行的标准是95%可信限下微生物残存概率不超过0.1%，大致相当于3000瓶产品中不得有1瓶染菌的水平。美国FDA的标准要求更为严格，通俗的表达为5000瓶产品中不得有1瓶染菌，必须通过培养基灌装模拟试验来验证生产工艺能达到上述标准。药品生产企业通常采用的灭菌方法：药品生产企业通常采用的灭菌方法：中国药典2005版二部附录XVⅡ和新版GMP灭菌法收载了常见的灭菌方法： 湿热灭菌法 干热灭菌法 辐射灭菌法 气体灭菌法 过滤除菌法灭菌的基本原理：灭菌的基本原理：⑴微生物死亡动力学 将微生物杀灭的灭菌法的基本原理都是使细胞内的蛋白质或核酸发生不可逆的凝固或破坏，使微生物死亡。因此，各种灭菌方法使微生物死亡的速度都符合一级动力学方程。以湿热灭菌为例，在特定灭菌温度下，某种微生物孢子死亡的速度仅与这个时刻孢子的浓度有关。用数学模型课表示为lgN=lgN0-kt N 产品内微生物的残存数 N0 灭菌开始时产品内微生物数 t 累计灭菌时间 k 常数，与微生物耐热性、灭菌温度有关灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：⑵微生物的耐热参数 微生物的耐热参数，简称D值，是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所需的时间（分钟）。对湿热灭菌工艺而言，特定灭菌条件即灭菌温度。对于某些孢子，如嗜热脂肪芽孢杆菌，在生理盐水中，121℃的湿热灭菌条件下，D值超过1分钟。微生物孢子的D值，与孢子存在的环境密切相关。由于微生物变异的概率较高，同一种孢子的不同来源菌株和制备批次，其D值有可能不同。灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：⑶ 灭菌率 灭菌率L是表示不同灭菌温度所对应的灭菌效果的重要函数。灭菌温度为T℃时的灭菌效果，与121℃下同样灭菌时间的灭菌效果可通过以下公式进行换算： 灭菌率L=10(T-121）/Z 下表给出了湿热灭菌中，以121℃为标准灭菌时间，Z=10℃时不同温度下的灭菌率。 灭菌率L=10(T-121）/10灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）： 如表所示，以121℃为标准，灭菌率定为1.00时，110℃下的灭菌率为0.08，即110℃下同样灭菌时间的灭菌效果仅为121℃时的8%。相应的，121℃灭菌1分钟对微生物的杀灭效果，相当于在110℃下灭菌12.5分钟的杀灭效果；当以流通蒸汽（100℃）灭菌时，若要达到同样杀灭效果，则需要灭菌125分钟！灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：（4）标准灭菌时间 标准灭菌时间，即F0值是指在121℃下的灭菌时间。它的意义在于将不同灭菌温度下的灭菌工艺，按照灭菌效果等效的原则，换算为121 ℃下灭菌所需要的时间。 F0=L×t， F0 标准灭菌时间 L 特定灭菌温度下的灭菌率 t 灭菌时间灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：如110℃下灭菌30分钟的F0值计算：110 ℃的灭菌率为0.08， F0=0.08×30=2.4分钟，即110℃下灭菌30分钟相当于121 ℃下灭菌2.4分钟。 F0值是衡量、区分无菌保证工艺属于最终灭菌工艺还是非最终灭菌生产工艺的重要指标。美国FDA和欧盟习惯上都将灭菌F0值是否≥8分钟视为区别最终灭菌工艺和非最终灭菌生产工艺的标志。 更准确地区分最终灭菌无菌药品和非最终灭菌无菌药品的标准，是看该产品的无菌保证水平是否达到≤ 10-6灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：（5）无菌保证水平 了解了微生物死亡动力学和灭菌工艺的基本概念后，就可以通过计算得到某批产品的无菌保证水平。 lgSAL=lgN0-F0/D 我国和国际主要药典规定最终灭菌工艺生产的药品的SAL≤10-6。残存微生物的概率越低，无菌保证的风险越低。 无菌保证水平与标准灭菌时间（F0），灭菌开始时产品中的污染微生物总数（N0）和污染微生物的耐热参数（D）密切相关。该公式是确定灭菌工艺的最重要的理论基础。 灭菌的基本原理（续）： 灭菌的基本原理（续）：假定灭菌开始是产品中的污染微生物总数（N0）为100cfu/瓶，污染微生物的耐热参数（D）为1分钟，要达到无菌保证值不小于6的标准，灭菌F0值至少应达到：F0=（ lgN0-lgSAL ）×D=（lg100+6） ×1=8分钟，也说是需在121℃下灭菌8分钟。 同样的产品，如果要在110℃下灭菌，则相应的灭菌时间应为：t=F0/L110=8/0.08=100分钟。即需在110℃下灭菌100分钟才能达到药典规定的SAL≤10-6的标准。 若某复方氨基酸注射液采用110℃，30分钟的灭菌程序，起始污染微生物仍为100cfu/瓶，D值为1分钟，则lgSAL=lgN0-F0/D=lg100-L110×t/D=2-0.08×30/1=-0.4,SAL=10-0.4=0.398,即残存微生物的概率为0.398。 灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：美国药典根据灭菌工艺提供的F0值，最终灭菌工艺进一步分为残存概率灭菌和过度杀灭灭菌工艺工艺。 残存概率灭菌工艺 美国药典定义的残存概率灭菌工艺指F0值≥8分钟，但＜12分钟的湿热灭菌程序。适用于热稳定性不很好的产品，如复方氨基酸注射液、脂肪乳注射液、葡萄糖注射液和含维生素等的小容量注射液。对残存概率灭菌工艺而言，产品灭菌前污染微生物量（bioburden）及污染微生物的耐热性是确定灭菌工艺是否提供足够无菌保证水平的关键因素。因此，生产工艺过程应当将避免产品被耐热菌污染放在首位，而不是仅依赖最终灭菌过程杀死污染微生物。 灭菌的基本原理（续）： 灭菌的基本原理（续）： 同时，残存概率灭菌工艺对灭菌设备的热分布均匀性要求较高，对灭菌程序工艺参数控制的准确度也要求较高，需要对灭菌过程作精确的控制。总之，残存概率灭菌工艺应从灭菌前微生物污染控制和灭菌过程控制两方面入手，使得灭菌F0值较低的情况下也能确保达到药典规定的无菌保证水平。灭菌的基本原理（续）：灭菌的基本原理（续）：过度杀灭灭菌工艺 过度杀灭工艺是指F0值≥12分钟的灭菌工艺。热稳定性很好的产品如生理盐水以及包装材料和生产设备等的灭菌，通常采用过度杀灭工艺。采用过度杀灭灭菌工艺时，即使不考虑产品灭菌前的污染状况，也能保证无菌保证水平≤ 10-6 。而且灭菌程序参数的宽容度相对较大，对灭菌设备的热分布及灭菌过程控制精确度相对于残存概率灭菌工艺的要求较低。当然，这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。从控制细菌内毒素污染的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。选择灭菌方法决策树：选择灭菌方法决策树：无菌保证工艺选择的原则是：应优先选择无菌保证水平高的最终灭菌工艺，只有在经充分的工艺研究证明产品无法耐受各种最终灭菌工艺，而且临床确实需要该注射剂的前提下，才能选择非最终灭菌工艺。欧盟“欧洲药品评价局（EMEA）”在其规范性文件“选择灭菌方法决策树中将水溶性药品无菌保证工艺分为 1）灭菌条件为121℃，15分钟的湿热灭菌工艺； 2）灭菌F0值≥8分钟，SAL≤10-6的湿热灭菌工艺； 3）采用微生物截留过滤器的除菌过滤工艺； 4）需要采用无菌原料和预先灭菌的包装材料进行无菌配制和灌装的工艺。选择灭菌方法决策树：选择灭菌方法决策树：否能否采用121℃，15分钟湿热灭菌能否采用F0≥8的湿热灭菌，以达到SAL≤10-6121℃，15分钟湿热灭菌能否对药液除菌过滤无菌原料，无菌配制 无菌灌封是否否是是采用F0≥8的湿热灭菌，以达到SAL≤10-6 药液除菌过滤及无菌灌封 四、湿热灭菌工艺的微生物学验证 四、湿热灭菌工艺的微生物学验证工艺验证的目的：工艺验证的目的：一般理化项目如含量、pH、相对密度等均可以用数值表述，其变化通常是连续的过程，即可以从少量样品的结果比较可靠地推测出整体的结果。与理化检验相对应的无菌检查，其结果只有阳性或阴性两种状态。因此。从少量样品的结果推测整体的结果存在很大的限制，即基于抽样检验的无菌检查存在明显的局限性。 数学公式（p+q)n=1定量描述了无菌产品污染率q、取样量即样本数n和因未取到污染样品而使受污染批“通过”无菌检查的概率p之间的关系。工艺验证的目的（续）：工艺验证的目的（续）：例如，按照药典规定的无菌检查取样量为20瓶，假定该批产品污染率为5%，通过计算可知，随机抽取20瓶产品的结果是，所有样品均为未污染产品的概率为36%，即该批产品“通过”无菌检查的概率竟高达36%！显然，无菌检查至多证明接受检查的样品是无菌的，而无法证明该批产品是否达到药典规定的无菌保证水平。所以，只有通过证明无菌保证水平。所以，只有通过证明保证工艺的可靠性来推断产品无菌的无菌保证水平。湿热灭菌工艺验证的前提：湿热灭菌工艺验证的前提：在进行湿热灭菌工艺验证前，必须满足下列条件： 设备的安装确认、运行确认和性能确认已经完成； 相关的SOP已经生效； 关键工艺参数、关键质量属性和关键工艺步骤已经批准； 相关批记录已经生效； 设备的空载、满载热分布已经成功完成，冷点已经确认；湿热灭菌工艺验证的前提（续）：湿热灭菌工艺验证的前提（续）：真空泄漏和保压测试已经成功完成； 湿热灭菌程序和参数以及确定； 相关仪表的校验已经完成。通常验证包括以下内容：通常验证方案包括以下内容：1）最大和最小装载条件下的热穿透试验 应根据满载热分布试验的结果制定热穿透试验方案。 热穿透试验的目的是获取不同位置的产品在灭菌过程中实际达到的温度和F0值，从而了解不同位置的产品之间，以及与日常生产运行时灭菌设备记录的温度和F0值之间的差异。 应至少进行最大和最小装载条件下的热穿透试验。有多种装量规格的产品时，应至少分别进行最小和大装量规格产品的热穿透试验。通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：应科学合理地制定热穿透试验，以获取足够的数据判断不同位置的产品的热穿透结果是否存在显著性差异。一个灭菌工艺的热穿透试验应至少连续运行三次灭菌程序以证明其重现性。通常若满载热分布试验中发现有冷点或热点，应重点采集该位置的热穿透数据。 试验方案应详细说明验证使用的温度传感器的数量及其安装分布方式、装载的形式、试验采用真实产品还是模拟产品，各项试验运行灭菌程序的次数。如果使用模拟产品，应有数据证明模拟产品和真实产品间没有热穿透差异。通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：热穿透试验F0值的平均值加/减3倍的F0值的标准偏差应在该产品灭菌工艺F0值的允许范围内。例如8.5≤ F0平均-3STD≤ F0MEAN+3STD ≤ 16.5分钟。 使用同型号的多台灭菌设备时，如果安装确认、运行确认、空载热分布的试验和满载热分布试验证据表明多台灭菌设备间没有显著性差异，则可以合理减少每台灭菌设备的试验次数。应通过风险分析说明减少试验次数的合理性。通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：2）微生物挑战试验 通过微生物挑战试验应能证明拟定的灭菌工艺参数允许的最差灭菌条件下，通过该灭菌工艺能将符合预定的灭菌前污染微生物数量和耐热性限度的产品中的微生物杀灭至存活概率不超过百万分之一。 对于最低灭菌F0值不小于12分钟的灭菌工艺（即过度杀灭灭菌工艺），且已通过热穿透试验证明其最低灭菌F0值，可不进行微生物挑战试验。 对于最低灭菌F0值小于12分钟的灭菌工艺（即残存概率灭菌工艺），应进行微生物挑战试验。通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：生物指示剂 可通过采购或自行制备适宜的生物指示剂。详见中国药典2005版二部附录XVII灭菌法的相关章节。通常将生物指示剂定量加入到产品中进行微生物挑战试验。 常用微生物： 过杀：嗜热脂肪芽孢杆菌； 生物负载：从环境和工艺分离的指示剂，如大肠杆菌。通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：生物指示剂类型： 孢子条； 孢子混悬液（混悬介质中的） 生物指示剂的放置位置； 含生物指示剂的产品应集中放置在热穿透试验发现的冷点初。若无明显冷点，则均匀放置。 通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：试验方案 应根据热穿透试验的结果设计试验方案。若热穿透试验证明不同位置的产品间、不同装载量间、不同装量规格间的热穿透特性有显著差异，应至少选择灭菌通F0值最低的位置、装载量和装量规格（即最差条件）进行微生物挑战试验。 微生物挑战试验的形式通常为将生物指示剂定量加入产品中，制备成带有确定数量微生物孢子的受试产品，将产品安放在灭菌设备内的特定位置，以尽可能低的灭菌参数（接近拟定的灭菌参数的低限）运行灭菌程序，对受试产品进行无菌检查，通过计算确定受一定程度微生物污染的产品经灭菌后微生物的残存概率。通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：微生物挑战试验的重要参数有： 生物指示剂在受试产品中的D值。以Di表示。 生物指示剂在每瓶受试产品中的接种数量。以Ni表示。 正常生产时产品中污染微生物的数量限度。以N0表示。 正常生产时产品中污染微生物的耐热性限度。以D0表示通常验证方案包括以下内容（续）：通常验证方案包括以下内容（续）：根据“阴性分数法”的理论，每次试验安置20瓶接种生物指示剂的受试产品时，每瓶产品微生物孢子的接种量为：Ni=10D0(lgN0+6)/Di 若经过灭菌后所有受试产品无菌检查均为阴性，则证明该灭菌工艺能将灭菌前每瓶污染有微生物数N0，且其耐热性不超过D0的微生物杀灭，保证产品中微生物存活概率不超过一百分之一。 湿热灭菌工艺验证：湿热灭菌工艺验证报告：通常包括以下内容： 所参考的湿热灭菌工艺验证方案； 报告的编号； 运行参数的总结； 对所测得的试验结果的总结； 验证过程中的偏差和变更； 结论