2007. Vo1.28. NO.01 食鬓珊究乌并发 科学研究
78
猪小肠粘膜中肝素钠提取与精制工艺研究
任红媛,何泼,李红心
(陕西科技大学生命科学与
学院,陕西咸阳712081)
摘 要:以猪小肠粘膜为原料,进行肝素钠的提取与纯化,采用两种方法:一种是乙醇沉淀法,另一种是大孔阴离
子树脂交换法。主要是通过树脂交换法提取肝素钠粗品,然后采用高锰酸钾和过氧化氢两步氧化法对粗品肝素进
行除杂、提纯和精制,最后低温离心得到精品肝素钠。对传统的提取工艺条件进行了改进,并测得粗品平均收率为
2.257%,精品平均收率为0.741 %,其中粗品效价值为73.19 U/mg,精品效价值为146.38 U/mgo
关键词:肝素钠;提取;纯化
STUDY ON TECHNOLOGY OF HERPARIN EXTRACTION AND PURIFICATION FROM
SWINE INTESTINAL MUCOSA
REN Hong-yuan, HE Po, LI Hong-xin
(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology,
Xianyang 712081, Shaanxi, China)
Abstract: Herparin was extracted and purified from swine intestinal mucosa by two methods, precipitated by al-
cohol and exchanged by macropore anion-resin. The main experiment task was extracting crude Herparin from
swine intestinal mucosa by the second method (resin -exchange) and purifying it by two -step oxidated with
potassium permanganate and hydrogen peroxide, then centrifuged at low temperature and gained purified Her-
parin. Among the article,we got a set of best craft condition and measure the thick Herparin equally accepts the
rate as 2.257 %(73.19 U/mg), and the rarefied Herparin equally accepts the rate as 0.741 %(146.38 U/mg).
Key words: Herparin; extraction; purification
作者简介:任红媛(1981-),女(汉),研究生,研究方向:生物化学及应用微生物。
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收稿日期:2006-10-27
科学研究 食品研究与并发 2007. V61.28.NO.01
79一
肝素钠是一种由动物结缔组织的肥大细胞产生的
粘多糖,是一种夭然抗凝血物质,它在抗凝血,促进脂
蛋白酶释放和补体溶细胞体系等方面具有活性,被广
泛用于治疗血栓塞、暴发性流脑、败血症、肾炎、急性心
肌梗塞、动脉硬化等疾病,还具有澄清血浆脂质,降低
胆固醇等作用[[I-.q。从生物学角度来讲,肝素钠是一种
含硫酸脂的氨基葡萄糖、艾杜糖醛酸和葡萄糖酸的生
物活性物质。三硫酸双糖单位是肝素的主要双糖单位,
L一艾杜糖醛酸是双糖的糖醛酸。二硫酸双糖的糖醛酸
是D一葡萄糖醛酸。三硫双糖和二硫双糖以约3:1的比
例交替联结问。在机体内它与蛋白质结合成复合物存
在于肥大细胞中,可被蛋白酶解离出来,它在溶液中呈
强电荷的聚阴离子状态,与强碱性D254阴离子树脂
有较强的亲和力,易被吸附而分离。我国目前以猪小肠
粘膜提取肝素钠为主,从前的大规模生产得率较低,且
混有大量有害物质,不利于临床应用,目前国内所需肝
素还需大量进口,价格昂贵,故其粗品的生产绝大多数
是由个体生产户来完成,但由于工艺落后,人员素质不
高,导致生产水平的低下,产品质量难以保证,这给精
品的生产带来了困难,同时也使产品在国际市场上难
以得到较好的价位M。所以本实验主要是采用离子交换
的方法来提取肝素,并在其工艺参数上做一些研究,为
实际生产提供参照。
1.3.2精品生产工艺
粗品肝素钠塑髯溶解液树脂吸附 吸附后的树脂
乙醇沉淀 沉淀物塑髯溶解液一次氧化 氧化液2竺兔氧化液
乙醇沉淀 沉淀物M黔溶解液Mx01沉淀物-}!!聋沉淀物
-迷聋沉淀物M斗精品肝素钠
1.3.3根据《中国药典》生物检定统计法(附录XIV)中
的量反应平行线测定法计算[810
1.3.4 实验前称取收集到的猪小肠粘膜重量,然后将
实验得到的粗品和精品量分别与之比较,计算收率。
2 结果
2.1工艺参数
由本实验得到粗品生产工艺参数如表1,关键影响
因素为盐解、吸附和沉淀的pH值,盐解及沉淀时的温
度值。
Table 1
表1 粗品生产工艺参数
Producing technological parameter of crude Herparin
温度(℃) 时间(h)
?
?
?
?
? ?
? ?
?
?
?
?
?
? ?
?
?
? ?
?
?
?
?
?
盐解Salt in
吸附Adsorption
洗涤Abstersion
洗脱Washout
沉淀Deposition
精品生产过程中各个步骤的pH值和温度值均要
严格控制。精品生产工艺参数如表2所示。粗品与精品
的收率比较见表30
表2 精品生产工艺参数
Table 2 Producing technological parameter of purified product
条件
Condition
时间(h)
Time(h)
? ?
? ?
?
? ?
?
? ?
? ?
?
? ? ?
?
? ? ?
? ? ?
? ? ?
? ? ?
1 材料与方法
1.1 材料
猪小肠购自咸阳市肉联厂。猪小肠用流水冲洗干
净,剪开铺平,用刀片将肠粘膜刮下收集,分装于样品
袋中,冰箱保存备用。
1.2 试剂与仪器
肝素钠标准品(效价160 U/mg )(北京奥博星生物
技术责任有限公司),D-254树脂 (杭州争光化工集团
公司)等。
GIL-16A高速台式离心机(江南南达生物技术开
发公司),WH-3微型漩涡混合仪 (上海卢西
仪器
厂),D40-2F型电动搅拌器(杭州仪表电机厂),HS-25
型PH计(上海雷茨仪器厂)等。
1.3 方法
1.3.1粗品生产工艺
猪小肠粘膜
盐解、过滤
滤液
树脂吸附 吸附后的树脂竺黔树月旨
乙醇沉淀 沉淀.>1}7k.f}斗粗品
盐解Salt in
吸附Adsorption
洗脱Washout
沉淀Deposition
氧化Oxidated
二次氧化Two-step oxidated
沉淀Deposition
科学研究
,..} .._ v 80
2007. Vo1.28.NO.01 食品研究与开发
表3 收率统计
Table 3 Yield statistic
肠粘膜质量(9)
of intestinal mucosa(e)
粗品肝素钠(9) 粗品收率(%) 精品肝素钠(9) 精品收率(%)
ain(g) roduct(a) induct(%)arin(%)
1
2
3
4
5
平均值(%)Average(%)
104.1
272.1
241
1.8875
1.7439
330.1
440
3.1451
5.2445
5.0124
6.2841
10.3516
of crude He
3.021
1.927
2.080
1.904
2.353
2.257
2.2619
3.7856
0.694
0.724
0.685
0.860
0.741
注:1.第一次粗品用于鉴定实验。2.粗品收率为所得粗品肝素纳与肠粘膜的质量比,精品收率为所得肝素精品与肠粘膜的质量比。
2.2 效价测量结果
表4 粗品效价结果
Table 4 Potency of crude Herparin
Pf(Ulmg)
74.65
70.07
74.86
WM2M(19PT)
1.8730
1.8455
1.8742
0.0246
0.0121
0.0088
艺
W(1/SZ}
1652.46
6830.13
12 913.22
21395.81
3095.06
12 605.00
24 201.96
39902.02
5797.05
23 262.53
45 359.31
74 416.89
:P一 通过检定测得T的效价含量,M =+[,+T, SM 标准品的M
,W二1/SZM.
?
?
表5 精品效价结果
Table 5 Potency of purified product
PT(U/mg) WM'
149.28
140.13
149.72
0.0286
0.0141
0.0102
艺
W(1/S,W
1222.55
5029.93
9611.69
15 864.17
2657.82
10 796.74
20908.31
34 362.87
5778.10
23175.20
45481.85
74 435.15
注:同上表。
对照表4,5可知该精致工艺可提高肝素效价一倍
以上。
3 讨论
3.1材料预处理方法
肠粘膜必须新鲜,由于粘膜污染有许多微生物,长
时间保存会发酵产生肝素酶,分解肝素钠。另外,发酵
还会产生一些有害物质,使树脂中毒。粘膜在20℃-
30℃放置2411,收率将下降10%-30%。在碱性和5%
氯化钠条件下,可减缓微生物发酵和抑制肝素酶活性。
研究发现:添加碱液可以防止肠粘膜腐败,本实验将来
不及提取的新鲜肠粘膜用2.0 mol/L NaOH溶液调
pH9.5-10.0,置低温处作短期贮存气
3.2 粗品生产时控制NaCl的用量
从前的生产者为缩短生产时间,加大NaCl的用
量,一导致原料浪费,生产废液污染严重,所得产品纯度
受到影响,所以粗品提取时应严格控制NaCl的用量。
提取时,NaCl的量应控制在4%左右,待加热至55℃,
并在该温度下保温3h后,此时浆液中NaCl的量减
少;树脂吸附时NaCl浓度应加水调至3%,而洗脱时,
要保证NaCl的量不低于30%,在复沉和精制时,NaCl
的量也应不低于巧%,以保证肝素负离子转化为肝素
钠所需钠离子的量。
3.3树脂吸附时应调节适当搅拌速度
D-254树脂系多孔带强碱性胺基的有机聚合物,
能有效地吸附肝素聚阴离子,但是由于其交换能力较
强,但机械强度和耐磨性较差。所以吸附和洗脱时的搅
拌速度不宜过快,以50 r/min-60 r/min为宜;吸附完成
后分离树脂时,应采用虹吸法吸去上层溶液,而将树脂
保留在容器内。
3.4粗品提取时还应严格控制水解和吸附时的pH值
若肠粘膜水解溶解液的pH为1011,使浆液变得
浑浊且较粘稠,易堵塞树脂孔,不利于吸附;而溶液的
pH值控制在8.7-9.5时,浆液澄清度较好,树脂吸附率
得到了提高,吸附液的pH值调在6.57.5的范围内,
吸附的效果较差,而pH值控制在8.08.5的范围内,
树脂吸附肝素钠的效果好。
3.5 醇沉的操作方法
乙醇沉淀时,必须在搅拌的同时逐渐加人乙醇,以
避免局部乙醇浓度突然增高,而且最好是用预冷过的
乙醇,否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏,从
而降低其活性(9]0
3.6 精制前粗品肝素的预处理
当出现低效价肝素钠时,可通过二次乙醇沉淀进
行纯化[[1n。即将低效价粗品肝素钠全溶于5倍量的1%
NaCl溶液中,再加乙醇至40%左右,沉淀12h以上,
抽干沉淀物,再溶于2.5倍量的1%NaCl溶液,如上重
复操作一次,沉淀物用丙酮脱水两次,干燥。此外,实验
表明:在乙醇存在的条件下,HCl可使肝素钠的活性损
科学研究 食品研究与开发 2007. V61.28. N0.01
8了~二二二~
超声波一微波协同提取牛芬中类胡萝卜素
马利华.秦卫东,戴晓娟
(徐州工程学院食品系,江苏徐州 221008)
摘 要:研究了传统蒸馏法与超声波一微波协同萃取法对牛芳中类胡萝卜素提取率的影响,并通过正交实验确定了
超声波一微波协同萃取法的最佳提取条件为:超声波功率40 W,微波功率为350 W,萃取时间为30s,料液比1:25,牛
芳粉碎程度为60目。
关健词:牛芳;类胡萝卜素;超声波一微波协同萃取
STUDIES ON THE ULTRASONIC-MICROWAVE ASSISTED EXTRACTION TO EXTRACTION OF
CAPSORUBIN FROM ARCTIUM LAPPA L
MA Li-hua, QIN Wei-dong, DAI Xiao-juan
(Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, Jiangsu, China)
Abstract: It was studied that the effects of extraction of capsorubin from Arctium Lappa L for the hot reflux and
the ultrasonic-microwave assisted. At last, based on the orthogonal experiment,we determined the best extraction:
the ratio of the solid to liquid 1:25, the granularity of burdock dusts 60, ultrasonic power 40 W, the microwave
power 350 W, the extracting time 30 s.
Key words: Arctium Lappa L; capsorubin; ultrasonic-microwave assisted
基金项目:江苏省教育厅研究课
(05KJD550207)
作者简介:马利华(1966-),女,工程师,硕士,研究方向:食品加工。
月卜川,月卜朴闷卜肋月.叫.月卜阴川卜幽司卜啦闷卜.月卜,门卜,月卜 闷,的月.川司卜咖闷卜咖门卜协阅,即司卜 月卜小门卜,阅, 明卜‘,一月卜 闷卜眨闷卜引司卜 司卜 闷卜 闷卜二川卜叫一闷卜川一门卜 闷卜服阅卜中月卜山闷,卜巾闷卜
extraction
一L司卜 .月卜.吓州卜申月卜 闷卜引川卜 「月卜 一月卜份闷卜.川.闷一一门卜川卜月卜叫一阅卜 ‘司卜.加门卜.和阅,⋯月卜和叫卜引州卜们月卜
失10%以上。所以精制前应该先将乙醇沉淀得到的粗
品烘干,再用盐溶液溶解并调至低pH,可使活性损失
控制在1%-2%之内。
3.7 氧化过程操作注意事项
肝素钠的N一硫酸基对酸比较敏感,氧化剂可能
会将肝素降解成酸性产物,所以氧化精制收率仅有
80%左右[1101。在保证质量的前提下,尽量减少损失、提
高收率是生产的中心问题。肝素溶液在低pH下,随温
度的升高而失活严重,所以一般要先将肝素溶液预冷
(10℃以下)。低pH (1.5 )下肝素保存的时间越长活性
损失越大,所以必须快速过滤,这样产品效价可达到
140 U/mg- 160 U/mg,收率在95%以上fill0
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收稿日期:2006-04-21