细菌ghost疫苗的研究进展

2008年第5期 作者简介:常月红(1982～),女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究 生,主要从事动物疫病免疫预防研究 *通讯作者:E-mail:lsg960@sohu.com 用死的病原微生物接种动物能使机体产生抵抗病原体 的免疫反应。作为疫苗的制作原则,用死的传染性病原体替 代活的病原体已经得到广泛应用。死疫苗易通过化学或物理 方法灭活病原菌制得。完整的死菌苗与亚单位疫苗相比有一 个优势,即向免疫系统提呈排列复杂的抗原决定簇。然而,像 热处理、辐射或化学等常规灭活传染性病原体的方法会[0]导 致相关抗原位发生改变,因而减弱或改变疫苗的抗原性。 一些新的研究方法包括遗传灭活,即当病原菌携带的外源遗 传信息开启转录时可使有感染性的因子转变成非感染性,此 病原菌即可作为疫苗使用。还有一种方法是通过可控表达噬 菌体 PhiX174的裂解基因 E,通过非变性方法导致细菌裂 解,使革兰氏阴性菌的胞膜产生跨膜通道从而形成无胞质成 分的有完整胞膜结构的细菌菌影(BacterialGhost)。它保留了 和活菌一样的细菌胞膜结构和功能以及相关抗原蛋白,E蛋 白介导的跨膜通道的形成仅限制于整个细胞表面的很小的 区域里,不会使细胞表面结构发生任何物理或化学变性。 BacterialGhost还是一种极好的传递系统,它能把外源靶蛋 白或其它抗原传递给抗原提呈细胞。除此之外,ghost还具有 极好的佐剂性质。 1E蛋白介导的细菌溶解及BacterialGhost的产生 E蛋白介导的裂解系统来源于大肠杆菌特异的噬菌体 PhiX174。裂解基因 E编码含有 91个氨基酸的蛋白质(大约 10kDa左右),发挥其溶解酶的功能使细胞内外膜融合从而 形成跨膜通道,胞质内容物由于胞浆与培养基的渗透压差而 被释放出来。细菌的胞质内容物通过这个直径约 40～200nm 的通道被释放出来,剩下一个没有细菌核酸、核糖体和其它 物质的空壳。 免疫电子显微技术和蛋白酶 K保护作用的研究表明,E 蛋白形态构象的改变能诱导细胞溶解。E蛋白介导的溶解过 程分为3个步骤。第1步:E蛋白整合到内膜上,其C-末端 朝向细胞质;第 2步:E蛋白形态改变,其 C-末端穿过细胞 内膜;第 3步:内外膜局部发生融合,与此同时 E蛋白的 C- 末端转向细菌细胞外膜表面。 有人提出,这种构象改变的机理可能是在溶解过程的第 1步即初期时,E蛋白中第一个嵌膜的 α-螺旋中第 21个残 基脯氨酸(P21)发生了顺反异构现象。P21转变成丙氨酸、甘 氨酸、丝氨酸或缬氨酸均能导致E蛋白突变失去溶解功能。 电子显微技术研究着重指出 E蛋白特异的跨膜通道结构不 是随机分布在胞膜上,而是限定于细胞分裂位点的区域,主 要是在细胞的中部或两极。分裂功能缺陷的突变株(ftsZ84, ftsA12)能够耐受 E蛋白介导的细胞溶解,而 ftsA3、ftsQ、ftsI 等其它突变株在非溶解条件下被溶解。结果表明,细胞分裂 的启动在 E蛋白介导的革兰氏阴性菌溶解过程中起到了非 常重要的作用。 除溶解的通道以外,细菌的形态以及所有细胞表面结构 均未受到任何影响。由于E蛋白缺乏酶活性,便产生了一种 假说:溶解是由宿主细胞的自溶酶诱导引起的。近年来,人们 通过比较 E蛋白介导的大肠杆菌溶解之前以及溶解过程中 其胞壁质成分的不同重新研究了这一假说。分析表明,胞壁 质的所有成分在E蛋白介导溶解后均未发生变化。但是,E 蛋白的作用似乎激发了胞壁质的降解,在总产物中胞壁质转 换产物的量增加了10%。由E蛋白介导使宿主细胞磷脂成分 发生的变化,极有可能促使内外膜融合。 溶解基因E的表达可在λ pL/pR-cI857或在lacPO-lacIq 启动阻遏系统的转录控制下完成。目前已经构建了一些含有 不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特异性溶解 质粒。右侧的λ pR启动子和温敏阻遏物cI85730℃以下能 抑制基因E的表达,高于30℃会导致阻遏物cI857热灭活而 诱导E基因表达。为了制备ghost,细菌须在28℃条件下生长 到对数生长期,然后升温到 42℃诱导其溶解。由于在不同的 环境条件下细胞表面的抗原决定簇可以发生改变,所以修饰 λ pR启动子/cI857阻遏系统使病原菌在诱导溶解前可以在 37℃下培养是有利的。近年来,λ pR启动子/操纵子区域被 突变从而构建了新的表达系统,能在37℃下稳定地抑制E基 因的表达,但是在39～42℃范围内仍然能诱导细胞溶解。 E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌 株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支 气管败血博特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放 线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓 杆菌、恶臭假单胞菌等。范围如此之大说明了只要 E溶解盒 被引入到适当的载体中,E蛋白介导的溶解可能会在每个革 兰氏阴性菌中发生。但在革兰氏阳性菌中,E基因的表达使 细菌被杀死而不是溶解。 2 BacterialGhost在实验动物体内产生免疫应答 为了确定BacterialGhost激发机体产生体液免疫应答的情 况,已使用鼠、猪、兔等不同动物进行试验。免疫途径包括腹膜 内、皮下或气雾免疫,加强或不加强免疫。用未杀死的完整细胞、 热灭活或X-射线灭活的细胞、ghost或特异靶蛋白做包被抗原 的ELISA试验对这些实验动物的血清样本进行了分析。 2.1 大肠杆菌 ghost 为测试 bacterialghosts引起的体液免 细菌ghost疫苗的研究进展 常月红 1,2,刘思国 2*,王春来 2,王勇 1,2,刘建东 2,宫强 2,邵美丽 1,2,,郭设平 2 (1.东北农业大学,哈尔滨 150030; 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 动物细菌病研究室,哈尔滨 150001) 专论与综述 17 畜牧兽医科技信息畜牧兽医科技信息 疫反应,用2×108大肠杆菌ghosts通过腹腔注射和皮下注射 两种方式免疫雌性 CD1小鼠,21d和 32d后用同样剂量进行 加强免疫。40d后用活的大肠杆菌NM522全菌体做包被抗原 对血清样本进行ELISA分析。发现腹腔注射的小鼠对大肠杆 菌表面结构产生的 IgG反应优于皮下注射。抗体效价在 64000～128000之间。 淋巴细胞增殖试验研究了细胞免疫系统的激发情况。兔 经过大肠杆菌 ghost皮下免疫后,其外周血淋巴细胞(PBL)经 分离培养后用相同的大肠杆菌 ghost或用无关的物质(牛痘 重组HIV-1gp160和HIV-1gp120特异肽)进行刺激。结果表 明,用HIV-1成分培养不能刺激PBL增殖(刺激指数<3),而 用大肠杆菌 ghosts再次刺激 PBL会发现强的细胞免疫反应 (刺激指数在19.4～88.6之间)。 2.2 肺炎克雷伯氏杆菌 ghost 有人对肺炎克雷伯氏杆菌现 地分离株(Kpn3)制备的 ghost在小猪体内引起免疫反应的能 力进行了研究。给约 18kg的四只 SPF小猪皮下注射 1、10、 100和 1000pg的 Kpn3-ghosts。16d后用相同剂量同样方法 进行加强免疫,31d后用相同剂量腹腔注射加强免疫。分别 在第0、7、14、24、50d采血,用未处理的Kpn3完整细胞做包 被抗原做 ELISA试验分析 Kpn3表面特异 IgG免疫球蛋白。 最初的小剂量免疫即可检测到抗 Kpn的 IgG,第 1次加强免 疫可进一步刺激 IgG的产生。在抗原剂量达到最高时,Kpn 抗体效价升高最大,并且再次应用相同剂量加强免疫时,Kpn 抗体效价显著升高。第2次加强剂量则不能增加 Kpn3特异 抗体效价。用Kpn3-ghosts免疫的四个动物中至少有两个特 异抗体效价有6～10倍的显著升高。特异抗体效价升高4倍 以上代表克服了自然感染 [14],因此用肺炎克雷伯氏杆菌 ghost免疫得到的抗体效价相当于毒力菌株感染之后得到的 抗体效价。免疫肺炎克雷伯氏杆菌Kpn3-ghosts的猪血清也 能够表现出对肺炎克雷伯氏杆菌 A565(人体分离株)的反应 性,表明用细菌ghosts免疫也能够有效抵抗相关亚种。 2.3 霍乱弧菌ghost 霍乱弧菌ghost(VCG)已被看作是一种 预防霍乱的候选死疫苗。与灭活完整弧菌细胞相比(WCV), VCG免疫原性的潜力可通过小鼠腹膜免疫评估出来。微量滴 定技术可检测抗弧菌抗体,ELISA试验可检测弧菌特异性 IgG抗体。在所有免疫VCG或WCV的动物的血清中可检测 出高强度的弧菌特异性反应。当用 VCG进行滴定时,VCG和 WCV免疫的小鼠抗体效价都很高。就抗弧菌抗体的血清阳 转来说,两种抗原制剂的免疫原性是相当的。这些结果证明 VCG可用作可靠的疫苗传递系统诱发弧菌特异的血清免疫 球蛋白 IgG抗体反应,还可以通过腹膜免疫小鼠诱发抗弧菌 的抗体活性。 3 BacterialGhost作为佐剂 激发免疫应答的能力不仅依赖于抗原的分子性质或宿主 的免疫原敏感性,而且还依赖于抗原成分。木薯淀粉、明矾、弗 氏佐剂、霍乱毒素、淋巴毒素、凝集素、胞壁酰二肽、免疫刺激 复合物、脂多糖和其它细胞壁成分等佐剂,与用天然的或合成 的聚合物一样用于非特异增强针对靶抗原的免疫应答。尽管 尚未知道每种佐剂如何增强免疫应答,但是我们相信在注射 部位延长抗原的沉积时间是佐剂的主要特征之一。第二个重 要的作用是激活巨噬细胞和抗原提呈细胞释放免疫应答的调 节因子。BacterialGhost包括一些熟知的免疫刺激复合物,例 如脂多糖或脂质A和肽聚糖。因此,ghost本身或作为外源蛋 白的载体应该能够加强针对靶抗原的免疫应答。 经皮下注射比较与 ghost、明矾或 CFA结合的 HIV-1 RT的免疫原性,发现与这3种佐剂结合的RT引起的免疫应 答无较大差异。而经腹腔注射时,与ghost结合的RT和与明 矾、CFA结合的RT相比可产生较高的IgG反应。 4 重组BacterialGhost 为制备细菌和病毒病原体的重组疫苗或把 ghost作为其 它抗原的载体系统,将外源蛋白附在细胞质膜的内表面从而 形成了膜靶向系统。把外源 DNA序列克隆到膜靶向载体 pMTV5上,任何抗原基因都能表达为含有 N-、C-或 N-/C- 末端膜锚着点的杂合蛋白,在E蛋白介导溶解之前锚定在细 菌封套复合物上。包埋到细胞内高免疫刺激环境的重组 ghosts携带的外来抗原可以启动有效的免疫应答。细菌封套 的佐剂成分包括脂多糖、肽聚糖、脂质和其他所有促进初级 抗原提呈细胞吸收的封套复合物的有效诱导剂。 重组 ghost作为抗原,其优点包括:(1)作为疫苗或抗原载 体的ghost来说,其制作过程不涉及灭活所导致的抗原变性; (2)重组蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中;(3)不 限制外源蛋白的大小,可同时提呈多价抗原决定簇;(4)Bac- terialGhost制备成本低,可大规模生产;(5)重组 ghost稳定性 好,无需冷链贮藏系统。 5 重组BacterialGhost的遗传风险率评估 基因工程疫苗的一个主要问题是其 DNA成分。重组的 完整细胞疫苗不仅包括重组的抗原物质而且包括外源遗传 信息,例如不相关的毒力因子。这意味着含有外源基因的重 组体存在着潜在的危险。最近报道指出死的奈瑟氏菌释放的 DNA有时会通过转化介导调控同源菌的毒力决定簇或者使 共生菌转变成病原菌。与重组的活菌苗不同,Bacterialghost 内没有核酸,E蛋白介导的溶解导致细菌基因组和重组质粒 等胞质成分外流。因此其作为疫苗进入动物体内后基因水平 转移的风险较小,具有更高的生物安全性。 E基因作为生物自杀系统在其他生物技术方面的应用 表明,只含有E基因而不含有抑制基因的质粒不能在外源细 胞中存在。因此,携带用于表达病毒来源或细菌来源的外源 DNA的膜靶向系统和无相应抑制基因的 E溶解系统的质粒 不应该被转化到新受体中。 6 结 论 用灭活的微生物免疫可以使免疫系统接触危险病原的时 候仍处于安全状态。因为ghost的特异性受体识别蛋白与活菌 的相同,所以它同活菌一样能够结合到宿主组织表面。这个特 性使细菌ghost能够被很好地改造,以便使ghost自身及其携 带的外源物质能很好的结合在宿主组织表面。APC(抗原提呈 细胞)对ghost的有效吸收使外源重组抗原,即镶嵌在外膜、胞 质空间或结合在细菌内膜上的外源抗原能够更容易地诱导免 疫应答。除了能够提呈天然的抗原之外,ghost免疫方法还能够 通过联合尽可能多的外源抗原到适合的细菌载体的方式提供 多价疫苗的唯一可能性。将来的疫苗试验将证明候选 ghost疫苗在无更多佐剂存在的情况下是否像口服疫苗那样依 然有效、稳定,是否便于管理。 (参考文献20篇从略) 专论与综述 18