巨噬细胞制备流程

巨噬细胞制备流程 巨噬细胞制备流程 1．实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌 3×TG 1ml（勿注入肠内）。 2．拉颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75％酒精中3～5秒。 3．置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。 4．再用75％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml 无血清RPIM-1640液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。 5．用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。 6．小心拔出针头，把液体注入离心管中，1500rpm离心10分钟，去上清，加5 ml RPIM-1640+10％NBS培养基。 7．计数细胞，每只小鼠可产生10～20×106细胞，其中90％为巨噬细胞。 8．为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。 9．为纯化培养细胞，去除其它白细胞，过夜后，去除培养液，用无血清RPIM-1640液冲洗1～2次后，再加新RPIM-1640+10％NBS培养液置37℃ CO2温箱中培养。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下： 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。 4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。 5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。 6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。 10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。