小鼠巨噬细胞的制备与培养

小鼠巨噬细胞的制备与培养 小鼠巨噬细胞的制备与培养 一、目的:建立一种简便的巨噬细胞分离与培养方法 , 为骨替代材料降解产物的研究提供巨噬细胞。 二、方法:以无血清 DMEM 培养液灌洗小鼠腹腔 ,10 min后吸出灌洗液于含 10 %胎牛血清的 DMEM 培养液中培养。采用HE染色和倒置显微镜观察细胞形态;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;墨汁颗粒吞噬实验检测其吞噬功能。 三、结果:获得高纯度的巨噬细胞 ,具有巨噬细胞的形态特征 ,良好的吞噬功能 ,含水解酶类。 四、结论:本法是一种简易而实用的体外分离培养腹腔巨噬细胞的方法。 巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明巨噬细胞具有吞噬与清除异物及分泌生物活性物质等广泛的生物学作用。为了深入研究巨噬细胞对仿生全降解 Ca2P 材料降解后的无机产物参与生命过程中有机物的合成作用 ,本实验对已有腹腔巨噬细胞分离培养方法加以改良 ,建立了一种简便而经济的小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养方法。 1 　 材料与方法 1. 1 　 主要试剂和仪器 　DMEM 培养基( Gibco) ,胎牛血清 ( Hycolon) ,二氧化碳培养箱 (美国 FormaCo. ) ,倒置显微镜及照相系统(Olymp us IX250) 。 1. 2 　小鼠腹腔巨噬细胞的分离、 培养 　脱颈处死628 周龄昆明种小鼠 (中国预防医学科学院提供) ,75 %酒精浸泡 5 min 后 ,倒立小鼠并腹腔注入无血清DMEM 培养液 5 ml , 仰卧平放并轻揉小鼠腹部 223 min , 静置 527 min 后 ,无菌条件下打开小鼠腹腔 ,观察肠管变扁且腹腔液为淡黄色时 ,用注射器抽取腹腔液约 424. 5 ml ,离心洗涤后显微镜下计数 ,常规DMEM 培养液(含 10 % 胎牛血清 ,青霉素 100U/ ml , 链霉素 100μg/ ml)调整细胞至所需浓度 ,接种于培养瓶及放有无菌盖玻片的 6 孔板内 ,置于37 ℃, 5 % CO2培养箱中。培养 12 h 后换液 ,以去掉少数未贴壁细胞。 1. 3 　 培养细胞的形态学检查 1. 3. 1 　 活细胞形态观察 　细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况。 1. 3. 2 　HE染色 　细胞培养 3 d 后取出 , PBS 洗 3次 ,甲醛固定, 常规 HE染色 ,中性树胶封固。 1. 4 　细胞吞噬功能检测 　细胞培养 7 d 后行墨汁吞噬试验 ,在培养体系中加入 10 % 墨汁 50μl ,放回培养箱中孵育 ,3 h 后取出盖玻片 ,PBS冲洗 ,甘油明胶封片。镜下计数200 个细胞 ,计算其吞噬率。 1. 5 　 细胞的酶化学检测 1. 5. 1 　酸性磷酸酶染色 　将培养 325 d 的细胞以Gomori 酸性磷酸酶(ACP)硫化铅法染色 ,阳性反应为棕黄色或棕黑色颗粒或片块状沉淀 ,定位于细胞胞浆中。光镜下每张载片计数 200 个细胞 ,求出阳性率。 1. 5. 2 　 α 2醋酸奈酚酯酶染色( α 2ANE) 培养527 d的细胞经 PBS 冲洗后 ,于冷甲醛2丙酮缓冲液中固定10215 min ,流水冲洗后 ,入孵育液(10 mgα 2醋酸奈酯溶于 0. 4 ml 丙酮中 ,加入 1/ 15 mol/ L PBS 40ml , 再加入六偶氮副品红2. 4 ml 混合 , p H 5. 8) ,37℃ 孵育1 h ,流水冲洗 ,2 % 甲绿复染细胞核 ,甘油明胶封片。酶活性部位为弥漫性红棕色产物。光镜下每张载片计数 200 个细胞 ,求出阳性率。 2 　 结果 2. 1 　 分离培养的活细胞观察 　培养 24 h 后 ,镜下可观察到贴壁细胞呈圆形、 椭圆形、 三角形或不规则形 ,有伪足和突起。在培养过程中未见细胞有丝分裂相 ,因而细胞不增殖。培养 30 d后 ,绝大部分细胞仍然存活 ,细胞形态基本不变。 2. 2 　HE染色 　光镜观察可见细胞形状多样 ,界限清楚 ,有钝圆形突起。胞浆丰富 ,含许多颗粒及少量空泡。核大为卵圆形、 肾形、 马蹄形或不规则形 ,偏居于细胞的一端,着色较深。 2. 3 　培养细胞的鉴定 　将培养 7 天的细胞做 3 h的吞噬试验 ,发现培养细胞对墨汁颗粒有很强的吞噬作用 ,吞噬率为95. 68 %。酸性磷酸酶及非特异性酯酶的阳性率也很高 ,分别为89. 66 %和85. 19 % 。 3 　 讨论 随着体外分离培养细胞技术的发展 ,巨噬细胞的提取方法有多种 ,细胞来源有猪、 兔、 大鼠、 小鼠等 ,又由于研究目的不同 ,在体内提取细胞的部位也不尽相同 ,如提取肺血管巨噬细胞、 肾小球巨噬细胞 ,骨髓基质巨噬细胞、 腹腔巨噬细胞等。本实验选择来源容易又便宜的小鼠 ,提取其腹腔巨噬细胞。从大量文献可知腹腔巨噬细胞的提取方法虽然大致都是灌洗腹腔后 ,吸出含巨噬细胞的灌洗液 ,但具体操作也略有差异。有人先注入腹腔巨噬细胞刺激剂(如肉汤、 淀粉、 糖原、 矿物油、 蛋白胨等) ,以产生大量的巨噬细胞进入腹腔。就研究巨噬细胞的功能这一目的而言 ,虽然此法能收集到大量的巨噬细胞 ,但获得的巨噬细胞已不在是原体内巨噬细胞的功能基础 ,因而在一定程度上限制了巨噬细胞的应用。而本实验免去了抗原物质的准备和注入的繁琐工作,同时避免了注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能的影响 ,只通过增加易得而又便宜的小鼠数量 ,并注意操作时关键的几点 ,就可解决巨噬细胞数量少的问题 ,而且此方法有混入杂细胞比较少的优点。本实验提取巨噬细胞的方法 ,关键在于以下几点 ,也是对以往提取巨噬细胞方法的改进:①应使小鼠倒立 ,从下腹部一侧进针注入灌洗液(无血清培养液) ,以确保针眼收缩 ,不至于因腹腔液的增加而从针眼处出血 ,使血细胞混入巨噬细胞悬液中,给纯化带来麻烦; ②无菌条件下打开腹腔 ,直视吸取 ,可防止极易发生的因吸入肠系膜或腹膜等而堵塞针眼的现象 ,并可迅速而又接近完全地吸出灌洗液; ③轻揉腹部后要静置几分钟。如果时间适当 ,可看到肠管变扁且表面皱缩 ,注入的灌洗液由红色变为淡黄色 ,研究发现此时获得巨噬细胞较多 ,如果注入的灌洗液仍为红色 ,获得巨噬细胞则较少。分析此现象可能是游离出的大量巨噬细胞使其环境变为酸性所致。本实验获得的细胞经形态学观察具有体内巨噬细胞的形态特征。细胞形态不规则 ,有伪足和突起伸出 ,胞浆丰富 ,核大为卵圆形、 肾形、 马蹄形或不规则形。巨噬细胞具有许多功能特点 ,如吞噬功能、 胞内富含溶酶体等。吞噬是巨噬细胞的典型功能之一 ,酸性磷酸酶和特异性酯酶是溶酶体的酶 ,尤其ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶 ,也是巨噬细胞内最有代表性的水解酶之一。本实验中墨汁吞噬试验显示细胞的吞噬率为 95 % ,ACP 染色显示其阳性率为 90 %,ANE染色阳性率为 85 %。因此 ,来自于腹腔,具有吞噬功能 ,胞内富含 ACP及 ANE的细胞可证实为巨噬细胞。一种简易而又经济的小鼠腹腔巨噬细胞提取方法成功建立 ,为骨替代材料与巨噬细胞相关的研究提供了切实可行的实验手段。