H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

第３６卷　第１２期 西北农林科技大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．３６ Ｎｏ．１２ ２００８年１２月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．） Ｄｅｃ．２００８ 犎９亚型禽流感病毒血凝素基因 重组禽痘病毒的构建� 陈红英１，黄青云２，崔保安１，李新生１，赵　丽３，管　倩１ （１河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州４５０００２；２华南农业大学 兽医学院，广东 广州５１０６４２； ３郑州牧业高等专科学校 动物医学系，河南 郑州４５０００３） ［摘　要］　【目的】获得表达Ｈ９ 亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒。【方法】将含禽痘病毒启动 子ＬＰ２ＥＰ２驱动的犎犃基因，插入到禽痘病毒转移载体ｐＳＹ６８１中，获得重组转移载体ｐＳＹ６８１／ＨＡ。用脂质体将其 转染已感染亲本禽痘病毒ＳＦＰＶ０１７株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重 组，产生表达 ＨＡ的重组禽痘病毒ｒＦＰＶＨＡ。在含有Ｘｇａｌ的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后，对重组病毒进行 多次蚀斑克隆，并用间接免疫荧光法对感染重组病毒鸡胚成纤维细胞中犎犃的表达产物进行鉴定。【结果】以重组禽 痘病毒ＤＮＡ为，利用犎犃基因特异引物进行ＰＣＲ，扩增出１条约１．７ｋｂ左右的带。以间接免疫荧光法证实重 组禽痘病毒能表达 ＨＡ。【结论】成功构建了表达 Ｈ９ 亚型禽流感病毒犎犃基因的重组禽痘病毒，且构建的重组禽痘 病毒能表达具有生物学活性的 ＨＡ。 ［关键词］　Ｈ９ 亚型禽流感病毒；犎犃基因；重组禽痘病毒；基因工程疫苗 ［中图分类号］　Ｓ８５１．３１ ［文献标识码］　Ａ ［文章编号］　１６７１９３８７（２００８）１２０００７０７ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｇｅｎｅｏｆＨ９ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ ＣＨＥＮＨｏｎｇｙｉｎｇ１，ＨＵＡＮＧＱｉｎｇｙｕｎ２，ＣＵＩＢａｏａｎ１， ＬＩＸｉｎｓｈｅｎｇ１，ＺＨＡＯＬｉ３，ＧＵＡＮＱｉａｎ１ （１犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔犪狀犱犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔，犎犲狀犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犣犺犲狀犵狕犺狅狌，犎犲狀犪狀４５０００２，犆犺犻狀犪； ２犆狅犾犾犲犵犲狅犳犞犲狋犲狉犻狀犪狉狔犕犲犱犻犮犻狀犲，犛狅狌狋犺犆犺犻狀犪犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犌狌犪狀犵狕犺狅狌，犌狌犪狀犵犱狅狀犵５１０６４２，犆犺犻狀犪； ３犣犺犲狀犵狕犺狅狌犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵，犣犺犲狀犵狕犺狅狌，犎犲狀犪狀４５０００３，犆犺犻狀犪） 犃犫狊狋狉犪犮狋：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ（ｒＦＰＶ）ｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＨ９ａｖｉａｎｉｎ ｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ（ＡＩＶ）ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）．【Ｍｅｔｈｏｄ】犎犃ｃＤＮＡｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏ犅犪犿ＨⅠｓｉｔｅｏｆｐＳＹ５３８ ｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｈｅｎｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏ犛犳犻ⅠｓｉｔｅｏｆｐＳＹ６８１ｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ犔犪犮犣ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄ，ｐＳＹ６８１／ ＨＡ，ｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｎｔｈｅｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ（ＣＥＦ）ｐｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓＳ ＦＰＶ０１７．ＢｙｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｂｌｕｅｐｌａｑｕｅｓｏｎｔｈｅＣＥＦｏｖｅｒｌａｉｄｗｉｔｈａｇａｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＸｇａｌ，ｔｈｅｒＦＰＶＨＡｒｅ ｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰＣＲ．犎犃ｉｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｌｔｖｉ ｒｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄＣＥＦｗａｓｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｅｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓｃｏｎｔａｉｎｅｄ犎犃ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犎犃ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄＣＥＦｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｕｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＡＩＶ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅｒｅ  ［收稿日期］　２００８０１０２ ［基金项目］　国家“十一五”科技支撑计划专项（２００６ＢＡＤ０６Ａ０８） ［作者简介］　陈红英（１９６５－），女，四川仁寿人，副研究员，博士，主要从事分子免疫学和分子病毒学研究。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｈｙ９２７＠１６３．ｃｏｍ ［通讯作者］　崔保安（１９４８－），男，河南荥阳人，教授，博士生导师，主要从事分子病原学及分子免疫学研究。 Ｅｍａｉｌ：ｂａｏａｎｃｕｉ＠ｈｅｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ（ｒＦＰＶＨＡ）ｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｈａｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ． 犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｈ９ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ；ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｇｅｎｅ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇｖａｃｃｉｎｅ 　　近年来，由Ｈ９ 亚型禽流感病毒（Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎ ｚａｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）引起的禽流感（ＡＩ）在我国部分地区 广泛流行，给养禽业造成了严重的经济损失。油乳 剂灭活苗虽对该亚型禽流感的控制发挥了重要作 用，但由于其价格高、使用不便，且使用后会干扰免 疫监测和流行病学调查，存在免疫应激强烈、影响肉 品品质等缺陷［１］，其应用受到了一定限制。 禽痘病毒（Ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ，ＦＰＶ）是近年来研究 开发并逐渐转向实际应用的一个新的病毒载体［２３］， 能够高效表达外源基因，已成功应用于多种禽病源 基因的表达，如马立克病毒ｇＢ及ｐｐ３８基因、禽流 感病毒血凝素（犎犃）和核蛋白（犖犘）基因、传染性法 氏囊病毒Ａ片段病毒蛋白（Ｖｉｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＰ）２４３ 或 ＶＰ２ 基因，新城疫病毒血凝素神经氨酸酶 （Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，犎犖）及融合蛋白 （Ｆｕｓｉｏｎ，犉）基因等［４８］，并在接种后显示了良好的免 疫原性。与痘苗病毒相比，ＦＰＶ具有宿主特异性， 不容易散毒，对人类及其他哺乳动物无危险性等优 点。犉犘犞基因组庞大，可插入较长外源基因，构建 多价或多联重组病毒活疫苗，诱导机体产生体液免 疫和细胞免疫［９１１］，具有明显的优势，因而ＦＰＶ是 具有广阔应用前景的动物病毒载体。 为了克服ＡＩ油乳剂灭活苗的缺陷，本研究利用 禽痘病毒ＳＦＰＶ０１７疫苗株作为载体，构建表达Ｈ９ 亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒 （ｒＦＰＶＨＡ），以期为禽流感防治提供一种新型疫苗。 １　与方法 １．１　材　料 １．１．１　病毒和质粒　禽痘病毒ＳＦＰＶ０１７、含有禽 痘病毒早晚期启动子ＬＰ２／ＥＰ２的ｐＳＹ５３８质粒、含 有禽痘病毒同源臂的ｐＳＹ６８１质粒和含有犔犪犮犣基 因的ｐＳＣ１１质粒，均由中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所惠赠。Ｈ９ 亚型 ＡＩＶ 犎犃 基因的克隆质粒 ｐＧＥＭＨＡ，由河南省动物性食品安全重点实验室构 建并保存。 １．１．２　ＳＰＦ鸡胚　９～１１日龄ＳＰＦ鸡胚购自梅里 亚维通实验动物技术有限公司。 １．１．３　试　剂　ＦＩＴＣ标记的兔抗鸡ＩｇＧ（二抗）购 自Ｓｉｇｍａ公司；鸡抗 Ｈ９ 亚型ＡＩＶ阳性血清购自中 国农业科学院哈尔滨兽医研究所；ＷｉｚａｒｄＰｕｒｅＦｅｃ ｔｉｏｎＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、碱性磷酸酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶（Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ）购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司； ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎ公司；ＥＸＴａｑＤＮＡ 聚合酶，Ｘｇａｌ和ＩＰＴＧ， ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，限制性内切酶 犈犮狅ＲⅠ、 犛犪犾Ⅰ、犅犪犿ＨⅠ、犛犳犻Ⅰ、犖狅狋Ⅰ等均为宝生物工程 （大连）有限公司产品；低熔点琼脂糖购自 Ａｍｒｅｓｃｏ 公司；ＤＭＥＭ 购自 ＧＩＢＣＯ公司；小牛血清白蛋白 （ＢＳＡ）购自华美生物工程公司。 １．２　犎犃基因重组禽痘病毒转移载体的构建 １．２．１　犎犃基因的ＰＣＲ扩增　根据ｐＧＥＭＨＡ质 粒的犎犃基因序列设计１对引物，上、下游引物的两 端均引入犅犪犿ＨⅠ酶切位点（下划线部分）。上游引 物Ｐ１：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧ ＴＧＣＴＴ３′；下游引物Ｐ２：５′ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡ ＡＡＴＧＣＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＣ３′。该引物可以扩增 犎犃基因的全部序列，预期扩增的片段长度为１７０１ ｂｐ。引物由上海生物工程公司合成。 取ｐＧＥＭＨＡ质粒１μＬ，加入１０×Ｅｘ犜犪狇反 应缓冲液５μＬ、１０ｍｍｏ１／ＬｄＮＴＰ混合物１μＬ、上 游引物 Ｐ１ （５０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、下游引物 Ｐ２（５０ μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、灭菌双蒸水４０．５μＬ，混匀，加入Ｅｘ 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ进行ＰＣＲ反 应。ＰＣＲ反应程序为：９６℃３ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５６ ℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３６个循环；最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取５μＬＰＣＲ产物用１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶（含 ０．５μｇ／ｍＬＥＢ）进行电泳检测。 １．２．２　犎犃基因重组禽痘病毒转移载体的构建及 鉴定　回收１．２．１中ＰＣＲ产物，经犅犪犿ＨⅠ酶切、 电泳、回收，将 犎犃 片段插入到同样处理的质粒 ｐＳＹ５３８中，构建重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ（图１）。转 化 犈．犮狅犾犻ＪＭ１０９ 感受 态细胞，提 取重 组 质 粒 ｐＳＹ５３８／ＨＡ进行ＰＣＲ鉴定及用犈犮狅ＲⅠ、犅犪犿ＨⅠ 和犛犪犾Ⅰ进行酶切鉴定。挑选２个ＰＣＲ和酶切鉴定 均为阳性的重组菌进行序列测定。用 犡犫犪Ⅰ和 犘狊狋Ⅰ酶切ｐＳＣ１１质粒，用 犖狅狋Ⅰ酶切ｐＳＹ６８１质 粒，补平后连接得到重组质粒ｐＳＹ６８１／ＬａｃＺ。用 犛犳犻Ⅰ酶切重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ，切下含有禽痘病 毒早晚期启动子ＬＰ２ＥＰ２的犎犃基因片段，插入到 ８ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３６卷 ｐＳＹ６８１／ＬａｃＺ 的 犛犳犻Ⅰ 位点上，构建转移载体 ｐＳＹ６８１／ＨＡ（图２）。转化犈．犮狅犾犻ＪＭ１０９感受态细 胞，提取重组质粒。对重组质粒ｐＳＹ６８１／ＨＡ进行 ＰＣＲ鉴定，并用犖狅狋Ⅰ进行酶切鉴定。 １．３　重组ｒＦＰＶＨＡ的获得 质粒ｐＳＹ６８１／ＨＡ 的纯化参照 ＷｉｚａｒｄＰｕｒｅ ＦｅｃｔｉｏｎＰｌａｓｍｉｄＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ使用说明进行。 鸡胚 成 纤 维 细 胞 （Ｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ， ＣＥＦ）单层长满至８０％培养瓶时，用ＤＭＥＭ培养液 洗涤 ＣＥＦ单层细胞，然后感染禽痘亲本病毒 Ｓ ＦＰＶ０１７，３７℃感染１．５ｈ后吸弃病毒液，进行转 染，转染程序按ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００Ｒｅａｇｅｎｔ试剂 盒使用说明进行。转染后换成全培养液，于体积分 数５％ＣＯ２、３７℃培养箱中继续培养，待病变达到 ８０％单层细胞时收获细胞，反复冻融３次后，用于重 组病毒的筛选。 图１　 重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ的构建流程图 Ｆｉｇ．１　ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＳＹ５３８／ＨＡ １．４　重组ｒＦＰＶＨＡ的筛选及纯化 取上述转染种毒接种ＣＥＦ单层细胞，３７℃感 作２ｈ后吸去感染液，加入含１０ｇ／Ｌ低熔点琼脂糖 的ＤＭＥＭ营养琼脂，置细胞培养箱中培养７２～９６ ｈ，待出现典型的细胞病变，再覆盖一层含 ２５０ μｇ／ｍＬＸｇａｌ的ＤＭＥＭ营养琼脂进行染色，继续培 养１２～２４ｈ后挑取蓝斑，放入１ｍＬ无血清ＤＭＥＭ 培养液中，反复冻融３次后，进行新一轮的蚀斑纯 化，共进行５轮蚀斑纯化。同时以禽痘病毒ＳＦＰＶ ０１７接种ＣＥＦ单层细胞为阴性对照（ＣＫ）。 １．５　重组ｒＦＰＶＨＡ基因组中ＨＡ基因的ＰＣＲ鉴定 收取ｒＦＰＶＨＡ感染后产生病变的鸡胚成纤维 细胞，加入１００ｇ／ＬＳＤＳ使其终浓度为４ｇ／Ｌ，再加 入蛋白酶Ｋ使其终浓度为４０μｇ／ｍＬ，３７℃消化３～ ４ｈ，用等体积饱和酚及等体积饱和酚／氯仿各抽提１ 次，水相中加入２倍体积冷乙醇和１／１０体积３ ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ（ｐＨ４．８），混匀，于－２０℃冰箱沉淀１ ｈ；１２０００犵、４℃离心１５ｍｉｎ，弃上清液，用体积分数 ７０％乙醇洗涤沉淀，真空干燥，沉淀用灭菌的ＴＥ溶 解后作为模板备用。在ＬＰ２ＥＰ２上设计１条用于检 测犎犃基因的上游引物，引物序列为５′ＴＴＧＧＣＡ ＴＡＴＡＡＡＴＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＣ３′，用该引物和扩 增犎犃基因的下游引物Ｐ２可以扩增１７１０ｂｐ的片 段。引物由上海生物工程公司合成。 取重组病毒ＤＮＡ６μＬ，加入１０×Ｅｘ犜犪狇反应 缓冲液５μＬ、１０ｍｍｏ１／ＬｄＮＴＰ混合物１μＬ、上游 引物 Ｐ１ （５０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、下 游 引 物 Ｐ２（５０ μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、灭菌双蒸水３５．５μＬ，混匀，加入 ９第１２期 陈红英等：Ｈ９ 亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建 Ｅｘ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ进行ＰＣＲ反 应。ＰＣＲ反应条件为：９６℃３ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５ ℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３６个循环；最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。取５μＬＰＣＲ产物用１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶（含 ０．５μｇ／ｍＬＥＢ）进行电泳检测。 图２　重组质粒ｐＳＹ６８１／ＨＡ的构建流程图 Ｆｉｇ．２　ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＳＹ６８１／ＨＡ １．６　感染重组ｒＦＰＶＨＡ的ＣＥＦ中 ＨＡ表达产物 的间接免疫荧光鉴定 将纯化的重组禽痘病毒接种于２４孔细胞培养 板的单层ＣＥＦ上，３７℃、体积分数５％ＣＯ２ 条件下 培养至ＣＥＦ出现明显病变，移去培养液，以ＰＢＳ洗 涤、冷甲醇固定细胞，加入１∶２００稀释的鸡抗 Ｈ９ 亚型ＡＩＶ阳性血清和含１０ｇ／ＬＢＳＡ的ＰＢＳ，３７℃ 作用１ｈ。以含体积分数０．５％吐温２０的ＰＢＳ洗涤 ５次，再加入１∶１０００稀释的兔抗鸡ＩｇＧＦＩＴＣ荧 光抗体，３７℃下作用３０ｍｉｎ，最后以含体积分数 ０．５％吐温２０的ＰＢＳ洗涤３次，置于倒置荧光显微 镜下观察。以正常ＣＥＦ和感染禽痘病毒ＳＦＰＶ ０１７的ＣＥＦ为阴性对照。 ２　结果与 ２．１　重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ和ｐＳＹ６８１／ＨＡ的鉴定 重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ和ｐＳＹ６８１／ＨＡ的酶切 和ＰＣＲ鉴定结果见图３和图４。 ０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３６卷 图３　重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ的酶切和ＰＣＲ鉴定结果 Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒλ犈犮狅Ｔ１４ＩＦｒａｇｍｅｎｔ；１．犈犮狅ＲⅠ酶切； ２．犅犪犿ＨⅠ酶切；３．犛犪犾Ⅰ酶切；４．ＰＣＲ产物 Ｆｉｇ．３　ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＳＹ５３８／ＨＡｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎ （犈犮狅ＲⅠ，犅犪犿ＨⅠａｎｄ犛犪犾Ⅰ）ａｎｄＰＣＲ Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒλ犈犮狅Ｔ１４ＩＦｒａｇｍｅｎｔ；１．犈犮狅ＲⅠ； ２．犅犪犿ＨⅠ；３．犛犪犾Ⅰ；４．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ 图４　重组质粒ｐＳＹ６８１／ＨＡ的酶切和ＰＣＲ鉴定结果 Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒλ犎犻狀ｄⅢＦｒａｇｍｅｎｔ；１．犖狅狋Ⅰ酶切； ２．ＰＣＲ产物；ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ Ｆｉｇ．４　ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＳＹ６８１／ＨＡｂｙ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ（犖狅狋Ⅰ）ａｎｄＰＣＲ Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒλ犎犻狀ｄⅢＦｒａｇｍｅｎｔ；１．犖狅狋Ⅰ； ２．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ 　　重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ进行ＰＣＲ、电泳，出现１ 条长约１．７ｋｂ的特异条带；经犈犮狅ＲⅠ酶切、电泳得 到大小约４．６５和０．２５ｋｂ的２条带；经犅犪犿ＨⅠ酶 切、电泳得到大小约３．２和１．７ｋｂ的２条带；经 犛犪犾Ⅰ酶切、电泳得到约３．１和１．８ｋｂ的２条带（图 ３），与预期的结果相符。重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ的 测序结果表明，重组质粒ｐＳＹ５３８／ＨＡ中 犎犃 的核 苷酸序列及阅读框均完全正确，而且犎犃基因正向 置于禽痘病毒早晚期启动子ＬＰ２ＥＰ２的下游。转移 载体ｐＳＹ６８１／ＨＡ 用 ＬＰ２ＥＰ２启动子上的引物和 犎犃基因的下游引物Ｐ２进行ＰＣＲ扩增，经琼脂糖 凝胶电泳后可以观察到１条约为１．７ｋｂ的带；经 犖狅狋Ⅰ酶切、电泳出现２条带，其中一条大小约１．９ ｋｂ，另一条大小约为９ｋｂ（图４），与预期的犎犃片段 大小相一致。表明含禽痘病毒早晚期启动子 ＬＰ２ＥＰ２驱动的 犎犃 基因片段已正确地插入到 ｐＳＹ６８１的犛犳犻Ⅰ位点上。 ２．２　重组ｒＦＰＶＨＡ的纯化 将ｐＳＹ６８１／ＨＡ 转染至已感染禽痘病毒 Ｓ ＦＰＶ０１７的ＣＥＦ，ｐＳＹ６８１／ＨＡ与ＦＰＶ间发生同源 重组，由于所形成的重组病毒带有犔犪犮犣基因，故其 在含Ｘｇａｌ的营养琼脂上产生蓝色蚀斑（图５Ａ），对 照无蓝色蚀斑（图５Ｂ）。通过在培养皿和９６孔培养 板上多次连续蓝斑筛选，得到纯化的、生长稳定的重 组禽痘病毒ｒＦＰＶＨＡ，形成的蚀斑均为蓝色。 ２．３　重组ｒＦＰＶＨＡ基因组中犎犃基因的ＰＣＲ鉴定 从ｒＦＰＶＨＡ感染的ＣＥＦ中提取 ＤＮＡ，ＰＣＲ 扩增出１条长度约１．７ｋｂ的条带，而用禽痘病毒Ｓ ＦＰＶ０１７株ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，无扩增产物（图 ６），表明犎犃基因已重组到禽痘病毒基因组中。 图５　重组病毒ｒＦＰＶＨＡ感染ＣＥＦ后形成的蓝色蚀斑 Ａ．ｒＦＰＶＨＡ；Ｂ．ＣＫ Ｆｉｇ．５　Ｂｌｕｅｐｌａｑｕｅｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓｒＦＰＶＨＡ 图６　重组禽痘病毒ｒＦＰＶＨＡ中犎犃 基因的ＰＣＲ鉴定结果 １．禽痘病毒ＳＦＰＶ０１７；２．重组禽痘病毒ｒＦＰＶＨＡ； Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ Ｆｉｇ．６　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犎犃ｇｅｎｅｉｎｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒＦＰＶＨＡｂｙＰＣＲ １．ＦｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓＳＦＰＶ０１７；２．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓｒＦＰＶＨＡ；Ｍ．ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ １１第１２期 陈红英等：Ｈ９ 亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建 ２．４　感染重组ｒＦＰＶＨＡ的ＣＥＦ中 ＨＡ表达产物 的间接免疫荧光鉴定 间接免疫荧光试验显示，感染ｒＦＰＶＨＡ 的 ＣＥＦ胞浆和胞膜区均呈特异性绿黄色荧光（图７）， 而接种禽痘病毒ＳＦＰＶ０１７的ＣＥＦ和正常ＣＥＦ则 未呈现特异性绿黄色荧光着色，表明重组禽痘病毒 ｒＦＰＶＨＡ感染ＣＥＦ后，能有效表达亚型禽流感病 毒的 ＨＡ抗原。 图７　感染重组ｒＦＰＶＨＡ的ＣＥＦ中 ＨＡ表达产物的免疫荧光鉴定结果（×４００） Ｆｉｇ．７　ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄＨＡｉｎｒＦＰＶＨＡｉｎｆｅｃｔｅｄＣＥＦ（×４００） ３　讨　论 在疫苗控制 ＡＩ流行和传播研究中，为了克服 灭活疫苗对免疫监测的干扰，人们己经开发了多种 基因工程疫苗。由于 ＨＡ是ＡＩＶ中最主要的保护 性抗原，故一般利用 犎犃 基因来构建基因工程疫 苗。ＡＩＶ编码的其他蛋白，如表面蛋白ＮＡ、Ｍ２和 内部蛋白ＮＰ，均可诱生机体的体液免疫或细胞免 疫，但它们在保护性免疫应答方面所起的作用远不 及ＨＡ重要。Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等［１２］研究发现，含 犎犃 和 犖犃 基因的核酸疫苗能提供良好的免疫保护；只含 犎犃基因的核酸疫苗也能完全抑制机体排毒，但仅 含 犖犃 基因的核酸疫苗只能降低排毒。Ｗｅｂｓｔｅｒ 等［１３］的研究表明，表达犎犃基因的重组禽痘病毒可 对鸡产生１００％的保护；表达犖犘 基因的重组禽痘 病毒，即使在加强免疫的条件下也不能提供保护；而 共同表达犖犘和犎犃 基因的重组病毒，与单一表达 犎犃基因的重组病毒相比，免疫效果反而下降。以 上研究结果充分证明，犎犃是ＡＩＶ中最主要的保护 性抗原，能为机体提供良好的免疫保护力。 目前，研究较多的表达 犎犃 基因工程疫苗有： 表达犎犃基因的重组禽痘病毒疫苗、利用杆状病毒 表达ＨＡ蛋白而制备的亚单位疫苗及插入 犎犃 基 因的核酸疫苗，上述３种疫苗均不干扰免疫监测。 但从已有的研究结果来看，亚单位疫苗的免疫原性 不够强，需加入佐剂才能诱导其产生较强的免疫应 答且生产成本较高；核酸疫苗的研制才刚刚起步，还 有很多关键性问题亟待解决。表达 犎犃 基因的重 组禽痘病毒活载体疫苗，是目前研究最为深入、并且 最有可能首先应用于临床的基因工程疫苗［１４］。重 组禽痘病毒基因工程苗的保护力高，如表达 Ｈ５ 亚 型ＡＩＶ犎犃 的重组禽痘病毒疫苗对１日龄和５周 龄雏鸡的保护率达１００％［１５］。此外，这种疫苗还有 低成本的优势。因此，本研究选择禽痘病毒作为构 建抗Ｈ９ 亚型禽流感基因工程疫苗的载体。 本试验成功地将ＡＩＶ犎犃基因和犔犪犮犣报告基 因重组于ｐＳＹ６８１上，构建了 犎犃 基因重组禽痘病 毒表达载体，并在鸡胚成纤维细胞上转染成功，经过 连续３代的蓝斑克隆和筛选，获得了含ＡＩＶＨＡ基 因的重组禽痘病毒。经多次传代、筛选和纯化，使得 每个经Ｘｇａｌ染色的病毒蚀斑均呈现蓝色，得到了 １００％纯度的重组病毒。同时经多次传代纯化后的 重组病毒，Ｘｇａｌ染色未见白色蚀斑出现，证明该重 组病毒的遗传性状稳定。 本试验用ＰＣＲ方法证明了重组禽痘病毒 犎犃 基因的存在，但是外源基因的存在并不意味着外源 基因的表达。为了证明所构建的重组病毒是否对外 源基因进行了忠实而有效的表达，本研究采用了以 Ｈ９ 亚型ＡＩＶ阳性血清为一抗的间接免疫荧光试 验，对 ＨＡ糖蛋白的表达进行检测，结果证实重组 禽痘病毒不仅携带有 Ｈ９ 亚型ＡＩＶ犎犃 外源基因， 还对外源基因进行了有效表达。Ｔａｙｌｏｒ等［１６］用免 ２１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３６卷 疫荧光染色法证明，犎犃 基因重组禽痘病毒所表达 的糖蛋白主要存在于被感染细胞（即ＣＥＦ）的细胞 膜上，这说明用重组禽痘病毒表达的 ＨＡ糖蛋白， 其不仅抗原性与病毒感染后宿主细胞合成的糖蛋白 相同，而且存在部位也完全一样。这一点在本试验 中也得到证实。 ＡＩＶ中广泛存在抗原漂移和抗原转换的现象， 其抗原变异的频率很高。在 ＡＩＶ编码的各种蛋白 中，又以 ＨＡ的变异频率最高。因此在 ＡＩＶ防治 中，应针对当地流行毒株的 ＨＡ亚型研制疫苗。本 研究以２００２年Ｈ９ 亚型ＡＩＶ分离株的犎犃基因构 建重组禽痘病毒疫苗，对防冶目前正在我国发生和 流行的Ｈ９ 亚型禽流感具有现实意义。 ［参考文献］ ［１］　ＳｕａｒｅｚＤＬ，ＳｃｈｕｌｔｚＣｈｅｒｒｙＳ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＤｅｖＣｏｍｐＩｍｍｕｎｏｌ，２０００，２４（２／３）：２６９２８３． 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［８］　智海东，王云峰，张　晶，等．传染性喉气管炎新城疫鸡痘重组 病毒免疫效力的研究 ［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００５，３６（８）：８０７ ８１１． ＺｈｉＨＤ，ＷａｎｇＹＦ，ＺｈａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇＢｇｅｎｅｏｆｌａｒｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓｖｉｒｕｓ ａｎｄｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅｏｆＮｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＶｅｔｅｒｉｎａｒ ｉａｅｔＺｏｏｔｅｃｈｎｉｃａＳｉｎｉｃａ，２００５，３６（８）：８０７８１１．（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ） ［９］　ＣｏｔｔｉｎｇｈａｍＭＧ，ｖａｎＭａｕｒｉｋＡ，ＺａｇｏＭ，ｅｔａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓ ｏｆｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆＦｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓａｓｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔｖａｃｃｉｎｅｖｅｃｔｏｒｓｅｌｉｃｉｔｉｎｇＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｉｍｅｂｏｏｓｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｏｌ， ２００６，１３（７）：７４７７５７． ［１０］　ＪｇｅｒＥ，ＫａｒｂａｃｈＪ，ＧｎｊａｔｉｃＳ，ｅｔａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖａｃｃｉｎｉａ／ ｆｏｗｌｐｏｘＮＹＥＳＯ１ｖａｃｃｉｎｅｓｉｎｄｕｃｅｂｏｔｈｈｕｍｏｒａｌａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒ ＮＹＥＳＯ１ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］． ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００６，１０３（３９）：１４４５３１４４５８． ［１１］　ＨａｒｒｉｓｏｎＪＭ，ＢｅｒｔｒａｍＥＭ，ＢｏｙｌｅＤＢ，ｅｔａｌ．４１ＢＢＬｃｏｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｓＨＩＶｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ８Ｔｃｅｌｌｍｅｍｏｒｙｉｎａｐｏｘ ｖｉｒｕｓｐｒｉｍｅｂｏｏｓｔｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００６，２４（４７／４８）： ６８６７６８７４． ［１２］　ＪｏｈａｎｓｓｏｎＢＥ，ＢｕｃｈｅｒＤＪ，ＫｉｌｂｏｕｒｎｅＥＤ．Ｐｕｒｉｆｉｅｄｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎａｎｄｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅａｒｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｉｎｓｔｉｍ ｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｐｏｎｓｅｂｕｔｉｎｄｕｃｅｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｔｙｐｅｓｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，１９８９，６３（３）：１２３９１２４６． ［１３］　ＷｅｂｓｔｅｒＲＧ，ＲｏｔｔＲ．ＩｎｆｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ：ｔｈｅｐｉｖｏｔａｌ ｒｏｌｅｏｆｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９８７，５０（５）：６６５６６６． ［１４］　ＢｕｂｌｏｔＭ，ＰｒｉｔｃｈａｒｄＮ，ＳｗａｙｎｅＤＥ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄ ｕｓｅｏｆｆｏｗｌｐｏｘｖｅｃｔｏｒｅｄｖａｃｃｉｎｅｓｆｏｒａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ［Ｊ］．Ａｎｎ ＮＹＡｃａｄＳｃｉ，２００６，１０８１：１９３２０１． ［１５］　ＳｗａｙｎｅＤＥ，ＢｅｃｋＪＲ，ＫｉｎｎｅｙＮ．Ｆａｉｌｕｒｅｏｆａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｈｅｍａｇｇｌｕ ｔｉｎｉｎｇｅｎｅｔｏｐｒｏｖｉｄｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓｐｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈａｆｏｗｌｐｏｘｖａｃｃｉｎｅ ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ，２０００，４４（１）：１３２１３７． ［１６］　ＴａｙｌｏｒＪ，ＷｅｉｎｂｅｒｇＲ，ＫａｗａｏｋａＹ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８，６（６）：５０４５０８． ３１第１２期 陈红英等：Ｈ９ 亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建