荧光猝灭法对肉桂酸与人血清白蛋白间的相互作用的研究

第 2 8卷 ,第 4期 　 　　　　　　　　　　　光 谱 学 与 光 谱 分 析 Vol1 28 ,No1 4 ,pp9042907 2 0 0 8 年 4 月 　　　　　　　　　　　 　Spect roscopy and Spect ral Analysis April , 2008 　 荧光猝灭法对肉桂酸与人血清白蛋白间的相互作用的研究 赵 　妍 , 曹 　 , 韩凤梅 , 陈 　勇 3 湖北大学中药生物技术省重点实验室 , 湖北 武汉　430062 摘 　要 　白蛋白是血液循环系统中最丰富的一种蛋白质 , 能与许多物质结合 , 并起着运输蛋白的作用。文章 利用荧光光谱法研究了中药有效成分肉桂酸与人血清蛋白间的非共价结合特性。研究表明 , 在 p H 714 作用 液、286 nm 激发波长条件下 , 肉桂酸对人血清白蛋白的荧光发射有较强猝灭作用。当作用温度为 37 和 47 ℃时 , 肉桂酸与人血清蛋白间的结合常数 K分别为 11276 7 ×103 和 31404 1 ×103 L ·mol - 1 , 结合位点数 n 分别为 01758 6 和 01835 6 , 表明温度升高有利于两者的结合 ; 同时 , 根据不同作用温度时非共价结合复合物 的热力学参数变化 , 证明肉桂酸与人血清白蛋白分子间的结合力主要是疏水作用。研究结果为进一步研究 肉桂酸的药理作用 , 尤其是对血浆蛋白构像的影响提供了重要信息。 关键词 　肉桂酸 ; 人血清白蛋白 ; 荧光猝灭 中图分类号 : R33233 　　文献标识码 : A 　　　文章编号 : 100020593 (2008) 0420904204 　收稿日期 : 2006211202 , 修订日期 : 2007202206 　基金项目 : 湖北省杰出青年基金项目 (2002AC004)和中药生物技术省重点实验室开放基金项目 (2004CTM001)资助 　作者简介 : 赵　妍 , 女 , 1984 年生 , 湖北大学生命科学学院在读研究生　　3 通讯联系人　　e2mail : cy101610 @npc1 gov1cn 引 　言 　　药物与血浆蛋白的非共价结合是药物体内储存与分布的 特殊形式 , 对药物的体内过程与药效有重要影响。人血清白 蛋白是人血浆中最重要的载体蛋白 , 可与许多内源、外源性 化合物结合。探讨药物与人血清白蛋白间的非共价结合特 性 , 对探讨药物的体内过程及临床合理用药具有重要的指导 作用 [123 ] 。肉桂酸 (Cinnamic acid) 是中药肉桂的有效成分之 一 , 具有抗炎与抗真菌作用 [4 ] , 同时是一种重要的有机合成 中间体 , 广泛应用于医药、香料、塑料、感光材料、缓蚀剂和 交联剂等产品的生产中。肉桂酸结构见 Scheme 1。 　　蛋白质的荧光是来源于芳香氨基酸的芳香环的发光 , 这 种大分子的发光可以看成是相应的内在的发光。它代表氨基 酸发色团的总贡献也就是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及其衍 生物发光的总贡献 [5 ] 。因此我们应用荧光光谱法研究了药物 肉桂酸与血浆中最丰富的人血清白蛋白间的非共价相互作用 特性 , 如结合常数、结合位点数和结合力类型。 1 　实验部分 111 　实验仪器和材料 日本岛津公司 RF2450 型荧光光度计 (带恒温装置) ; 肉 桂酸 (Sigma 公司) , 人血清白蛋白 (以下简称 HSA , Sigma 公 司) , p H 714 Tris2HCL 缓冲液 , 实验用水为 2 次重蒸水 , 其 他试剂为国产分析纯 ; 3 ×10 - 3 mol ·L - 1肉桂酸水溶液储备 液 , 110 ×10 - 5 mol ·L - 1 HSA 水溶液储备液。 112 　实验方法 于 10 mL 比色管中依次加入 2 mL 015 mol ·L - 1 的 NaCl 溶液 , 2 mL Tris2HCl 缓冲溶液 , 2 mL HSA 储备液 , 用水稀释至 10 mL , 摇匀并于恒温水浴中预热 10 min , 取该 溶液 3 mL 放于 415 mL 荧光池中 , 以 286 nm 为激发波长、 狭缝与发射狭缝宽度为 10 nm , 在 300～400 nm 范围内扫描 荧光发射光谱。用移液枪分次加人肉桂酸溶液 10μL , 摇匀 并作用 6 min , 在上述条件下扫描荧光发射光谱。 2 　实验结果 211 　HSA的荧光猝灭光谱 实验选用了 37 和 47 ℃两个蛋白药物作用温度 , 在本实 验条件下 , 肉桂酸溶液荧光强度很弱 , 对 HSA 的荧光发射 光谱无影响。图 1 是作用温度为 37 ℃时 , 蛋白与不同量肉桂 酸相互作用时的荧光发射光谱图 , 其发光特征是由于人血清 白蛋白的 214 位的色氨酸残基的发光所致 [5 ] 。由图可知 : 固 定作用蛋白摩尔量 , 随着作用的肉桂酸摩尔量不断增加 , 虽 然 HSA 的荧光发射光谱的峰位和峰形不变 , 但 HSA 的内源 荧光强度均呈现有规律的降低 , 说明肉桂酸与蛋白之间形成 了复合物。 212 　肉桂酸对 HSA的猝灭机理 引起蛋白荧光猝灭的原因有动态和 (或)静态猝灭 , 动态 猝灭是一种电子或能量转移过程 , 不会影响蛋白质的二级结 构和生理活性。而静态猝灭是因为生成了配合作用 , 通常是 产生了不发荧光的配合物 , 对蛋白质的二级结构和生理活性 产生影响。荧光动态猝灭符合 Stern2Volmer 曲线方程 [6 ] F0 / F = 1 + Kqτ0 [ Q] = 1 + KSV [ Q] (1) 式中 , F0 是猝灭剂不存在时的荧光强度 , F 为加入猝灭剂后 的荧光强度 , KSV (L ·mol - 1 )表示生物大分子与荧光猝灭剂 分子彼此扩散和相互碰撞到达动态平衡时的量效关系 ; Kq (L ·mol - 1 ·s - 1 )为双分子表观猝灭常数 , 它反映了体系中 分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率 的影响。[ Q]为猝灭剂浓度。τ0 为猝灭剂不存在时荧光分子 的平均寿命 , 生物大分子的平均寿命约为 10 - 8 s[7 ] 。 根据 (1)式 , 把 F0 / F对所加入的肉桂酸的总浓度[ Q]作 图 , 得到对人血清白蛋白荧光的 Stern2Volmer 猝灭曲线 , 结 果如图 3 所示。由图 2 可以看出 , F0 / F随着肉桂酸浓度的增 加逐渐增大 , F0 / F与[ Q]线性关系良好。通过计算可知 , 作 用温度为 37 和 47 ℃时的荧光猝灭过程速率常数 KSV分别为 1 500 和 1 915 L ·mol - 1 。由于生物大分子的最大动态猝灭 过程的速率常数 KSV < 100 L ·mol - 1 , 而通过 Stern2Volmer 曲线方程求得的 HSA 与肉桂酸非共价结合的猝灭过程速率 常数比最大动态猝灭过程的速率常数大几个数量级 , 表明肉 桂酸对 HSA 内源性荧光的猝灭过程不是由扩散控制的动态 猝灭过程 , 而可能是静态猝灭过程。 213 　荧光给体一受体间平衡常数和结合位点数 对于静态猝灭过程 , 荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光 分子与猝灭剂分子间的结合常数表达式推导求出。设生物大 分子有 n 个相同且独立的结合位点 , 则其与小分子间的猝灭 反应可表示为 [8 ] nQ + B = QnB 其结合常数为 KA KA = [ QnB ]/ [ Q] n [ B ] (2) 式中 : [ B ] 是游离荧光体浓度 , [ Q] 是猝灭剂浓度 , [ QnB ] 是 配合物浓度。若荧光体总浓度为 [ B0 ] , 则 [ B0 ] = [ QnB ] + [ B ] , 当[ Q] > > [ B0 ] 时 , 以猝灭剂的起始浓度代替其平衡 浓度 KA = ( [ B0 ] - [ B ]) / [ Q] n [ B ] (3) 在静态猝灭中 , 体系的荧光强度 F 与其游离浓度成正比 (所 生成的配合物是非荧光性的) [ B ]/ [ B0 ] = F/ F0 (4) 由 (3)和 (4)式得 lg[ ( F0 - F) / F] = lg KA + nlg[ Q] (5) 根据 (5)式处理图 2 数据作图 3 , 得到如下线性回归方程。 作用温度为 37 ℃时 lg[ ( F0 - F) / F] = 01758 6 lg[ Q] + 31106 , r2 = 01999 1 (6) 作用温度为 47 ℃时 lg[ ( F0 - F) / F] = 01835 6 lg[ Q] + 3153 2 , r2 = 01996 (7) 根据 (6)和 (7)式可计算出作用温度为 37 和 47 ℃时的结合常 数 K和结合位点数 n 分别为 11276 7 ×103 L ·mol - 1 , 01758 6和 31404 1 ×103 L ·mol - 1 , 01835 6。 214 　荧光给体2受体间作用力的确定 有机小分子与蛋白质相互结合的主要部位是蛋白质上的 碱性氨基酸残基 , 它们是精氨酸、赖氨酸、组氨酸残基和 N 端氨基等。相互作用力有氢键作用力、静电作用力、疏水作 用和范德瓦耳斯力 [9 ]等。Masaki otagiri 出判断生物大分 子与小分子结合性质的热力学规律 , 即 : ΔS > 0 为疏水和静 电作用力 ;ΔS < 0 为氢键和范德瓦耳斯力 ;ΔH > 0 和ΔS > 0 为典型的疏水作用力 ; ΔH < 0 和ΔS < 0 为氢键和范德瓦耳 斯力 ;ΔH < 0 和ΔS > 0 为静电作用力。通过改变反应作用 509第 4 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析 温度 , 经 (8)和 (9)式 ln K2 / K1 = ΔH (1/ T1 - 1/ T2 ) / R (8) ΔG = ΔH - TΔS = - R Tln K (9) Fig13 　Plots of lg[ ( F0 - F) / F] vs lg[ Q] 　　可计算温度变化时药物蛋白结合的ΔH 和ΔS。式中 ,T1 和 T2 分别为 37 和 47 ℃的绝对温度 , K1 和 K2 为与之对应的结合常数。结果为 : ΔH = 81105 ×104 J ,ΔS = 3201 8 J·mol - 1 ·K- 1 。可见肉桂酸与人血清白蛋白之间的作用力主要为疏水作用力 , 且作用较稳定。3 　讨 　论　　HSA 中由于色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基的存在而具有内源荧光 , 肉桂酸本身在扫描范围内无荧光强度 , 但在与HSA 相互作用的过程中能不同程度地猝灭 HSA 的荧光强度。通过上述荧光猝灭研究发现 , 肉桂酸对人血清蛋白的猝灭机制属于静态猝灭 , 即肉桂酸与 HSA 之间形成不发荧光的复合物 , 出现无辐射能量转移时 , 产生了荧光体的静态猝灭 , 表明肉桂酸的加入使 HSA 的结构发生改变。肉桂酸与HSA 之间以疏水作用方式相互作用 , 温度的升高有利于两 者的结合 , 作用较为显著。 参 考 文 献 [ 1 ] 　L IU Yong2ming , L I Gui2zhi , SUN Xi2fen (刘永明 , 李桂芝 , 孙希芬) . 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The binding constant s ( K) at 37 and 47 ℃were found to be 11276 7 ×103 and 31404 1 ×103 L ·mol - 1 , with the number of binding site ( n) of 01758 6 and 01835 6 , respectively , suggesting that the reaction temperature is advantageous for the binding reaction in a way. The changes in the thermodynamic parameters of binding interaction at 37 and 47 ℃indicated that the main binding force between cinnamic acid and human serum albumin was hydrophobic force. These provide important information for studying the pharmacological effect s of cinnamic acid and the influence of cinnamic acid on the configu2 ration change of HSA. Keywords 　Cinnamic acid ; Humen serum albumin ; Fluorescence quenching (Received Nov. 2 , 2006 ; accepted Feb. 6 , 2007) 　　3 Corresponding author 709第 4 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析